Obtenção de criosecções de alta qualidade de olho de coelho inteiro

Resumo

Este protocolo descreve um método confiável para obter criosseções de alta qualidade de olhos inteiros de coelho. Ele detalha os procedimentos de dissecção, fixação, incorporação e seccionamento do olho do coelho, que podem ser facilmente adaptados para uso em qualquer estudo que utilize imuno-histoquímica em olhos maiores.

Resumo

Este protocolo descreve como obter criossecções retinianas de alta qualidade em animais maiores, como coelhos. Após a enucleação, o olho é brevemente imerso no fixador. Em seguida, a córnea e a íris são removidas e o olho é deixado durante a noite para fixação adicional a 4 °C. Após a fixação, a lente é removida. O olho é então colocado em um criomold e preenchido com um meio de inclusão. Ao remover a lente, o meio de incorporação tem melhor acesso ao vítreo e leva a uma melhor estabilidade da retina. É importante ressaltar que o olho deve ser incubado em meio de incorporação durante a noite para permitir a infiltração completa em todo o vítreo. Após a incubação durante a noite, o olho é congelado em gelo seco e seccionado. Cortes retinianos inteiros podem ser obtidos para uso em imuno-histoquímica. Protocolos de coloração padrão podem ser utilizados para estudar a localização de antígenos no tecido retiniano. A adesão a este protocolo resulta em criossecções retinianas de alta qualidade que podem ser usadas em qualquer experimento que utilize imuno-histoquímica.

Introdução

A retina é composta por várias camadas de células especializadas dentro do olho que, juntas, trabalham para converter a luz em sinais neurais. Como a retina desempenha um papel crítico na visão, entender sua estrutura e função pode fornecer informações valiosas sobre algumas das causas mais comuns de perda de visão, como degeneração macular e retinopatia diabética, entre outras.

Os coelhos servem como um modelo animal conveniente na pesquisa da retina, pois oferecem várias vantagens em comparação com outros modelos. Os olhos de coelho são relativamente semelhantes em anatomia aos olhos humanos ^1,2

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. Quatorze (n = 14) coelhos com cinto holandês entre 4 e 6 meses de idade foram utilizados no desenvolvimento deste protocolo. Foram utilizados animais machos e fêmeas. Todos os animais pesavam entre 2,0 e 2,5 kg. Todos os animais foram alojados individualmente. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados pode ser encontrada na Tabela de Materiais.

1. Preparação

1. Preparação do fixador.
   1. Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% ....

Discussão

Antes de implementar o protocolo acima, enfrentamos consistentemente dificuldades com o processamento tecidual de olhos de coelho para IHQ. Adaptamos vários protocolos dos olhos de animais menores, como camundongos, mas descobrimos que eles levavam a uma fixação inadequada e dificuldade de seccionamento do tecido. Existem várias considerações importantes que permitem seções consistentes e de alta qualidade da retina do coelho.

Uma consideração é o grande tamanho do globo do coelho e.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)