Obtenção de criosecções de alta qualidade de olho de coelho inteiro

Resumo

Este protocolo descreve um método confiável para obter criosseções de alta qualidade de olhos inteiros de coelho. Ele detalha os procedimentos de dissecção, fixação, incorporação e seccionamento do olho do coelho, que podem ser facilmente adaptados para uso em qualquer estudo que utilize imuno-histoquímica em olhos maiores.

Resumo

Este protocolo descreve como obter criossecções retinianas de alta qualidade em animais maiores, como coelhos. Após a enucleação, o olho é brevemente imerso no fixador. Em seguida, a córnea e a íris são removidas e o olho é deixado durante a noite para fixação adicional a 4 °C. Após a fixação, a lente é removida. O olho é então colocado em um criomold e preenchido com um meio de inclusão. Ao remover a lente, o meio de incorporação tem melhor acesso ao vítreo e leva a uma melhor estabilidade da retina. É importante ressaltar que o olho deve ser incubado em meio de incorporação durante a noite para permitir a infiltração completa em todo o vítreo. Após a incubação durante a noite, o olho é congelado em gelo seco e seccionado. Cortes retinianos inteiros podem ser obtidos para uso em imuno-histoquímica. Protocolos de coloração padrão podem ser utilizados para estudar a localização de antígenos no tecido retiniano. A adesão a este protocolo resulta em criossecções retinianas de alta qualidade que podem ser usadas em qualquer experimento que utilize imuno-histoquímica.

Introdução

A retina é composta por várias camadas de células especializadas dentro do olho que, juntas, trabalham para converter a luz em sinais neurais. Como a retina desempenha um papel crítico na visão, entender sua estrutura e função pode fornecer informações valiosas sobre algumas das causas mais comuns de perda de visão, como degeneração macular e retinopatia diabética, entre outras.

Os coelhos servem como um modelo animal conveniente na pesquisa da retina, pois oferecem várias vantagens em comparação com outros modelos. Os olhos de coelho são relativamente semelhantes em anatomia aos olhos humanos ^1,2. Por exemplo, os coelhos têm uma área de densidade aumentada de fotorreceptores, conhecida como faixa visual horizontal, que é análoga à fóvea em humanos. Outros modelos animais comumente usados, como roedores, não têm um equivalente anatômico. Além disso, em comparação com os roedores, a vasculatura da retina em coelhos é bastante semelhante à dos humanos. Os olhos do coelho também são relativamente grandes. Isso os torna particularmente adequados para estudos que envolvem administração de medicamentos ou intervenção cirúrgica no vítreo ou na retina que, de outra forma, poderiam ser difíceis ou impossíveis em um olho menor³.

A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica amplamente utilizada para estudar a localização de antígenos dentro de um tecido e tem amplas aplicações na pesquisa da retina ^4,5,6. Como a retina é uma estrutura delicada, a obtenção de resultados úteis via IHC requer um processamento cuidadoso do tecido. O descolamento de retina e outros artefatos teciduais, como quebras ou dobras da retina, geralmente ocorrem durante o processamento e podem interferir na interpretação dos resultados. O processamento bem-sucedido depende de uma variedade de fatores, incluindo manipulação do tecido, tipo e duração da fixação, tipo de meio de incorporação e técnicas de seccionamento 7,8,9,10. Apesar das vantagens de usar coelhos como modelo animal na pesquisa da retina, existem muito poucos protocolos que descrevem o processamento bem-sucedido do tecido da retina do coelho. Este artigo descreve um método confiável para obter seções retinianas de alta qualidade de olhos inteiros de coelho para uso em IHQ.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. Quatorze (n = 14) coelhos com cinto holandês entre 4 e 6 meses de idade foram utilizados no desenvolvimento deste protocolo. Foram utilizados animais machos e fêmeas. Todos os animais pesavam entre 2,0 e 2,5 kg. Todos os animais foram alojados individualmente. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados pode ser encontrada na Tabela de Materiais.

1. Preparação

1. Preparação do fixador.
   1. Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). No mínimo, são necessários 50 mL de fixador por olho.
2. Preparação de agente crioprotetor.
   1. Prepare 30% em peso por volume (p / v) de sacarose em PBS. Coloque em uma coqueteleira por pelo menos 15 minutos para garantir que a sacarose esteja completamente dissolvida. No mínimo, são necessários 50 mL de agente crioprotetor por olho.
3. Preparação do instrumento de dissecação.
   1. Reúna dois pares de pinças, uma tesoura curva, uma lâmina de bisturi e uma placa de dissecção de 100 mm e coloque-os perto de um microscópio de dissecação. Um exemplo de configuração é mostrado na Figura 1A.

2. Fixação inicial

1. Após a enucleação transconjuntival¹¹, coloque imediatamente o olho em pelo menos 50 mL de PFA a 4% em PBS no gelo. Certifique-se de que o olho esteja completamente submerso. Se as bolhas de ar se acumularem na superfície externa do olho, remova-as agitando suavemente.

3. Remoção da córnea e da íris

1. Após 15 min, remova o olho de PFA a 4% em PBS e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Encha o prato com PBS para evitar que o olho seque.
2. Remova a córnea.
   1. Comece fazendo uma incisão com uma lâmina cirúrgica 1 mm anterior ao limbo, paralela ao plano da íris para evitar perfurar acidentalmente as estruturas subjacentes (Figura 1B).
   2. Insira uma tesoura curva na incisão inicial e continue cortando circunferencialmente, permanecendo a 1 mm do limbo. Use uma pinça para estabilizar o olho durante o corte (Figura 1C).
   3. Quando o corte circunferencial estiver concluído, remova a córnea com uma pinça e limpe suavemente o excesso de PBS com um lenço de laboratório. Coloque a córnea em solução de sacarose a 30% em temperatura ambiente (RT) para crioproteção ou descarte. A crioproteção é completa quando a córnea afunda, o que normalmente leva menos de 1 h.
3. Remova a íris.
   1. Comece fazendo um corte inicial com uma tesoura curva através da íris. Separe completamente a íris do resto do tecido cortando circunferencialmente semelhante à remoção da córnea (Figura 1D).
   2. Quando o corte circunferencial estiver concluído, remova a íris com uma pinça e limpe suavemente o excesso de PBS com um lenço de laboratório. Coloque a íris em solução de sacarose a 30% em RT para crioproteção ou descarte como acima. A crioproteção é completa quando a íris afunda, o que normalmente leva menos de 30 minutos.

4. Conclusão da fixação

1. Com a córnea e a íris removidas, coloque o olho em pelo menos 50 mL de PFA a 4% recém-preparado em PBS e coloque-o em um shaker para agitação suave. Certifique-se de que o olho permaneça submerso durante a agitação.
2. Fique de olho em 4% de PFA em PBS a 4 ° C durante a noite.
   NOTA: Descobrimos que o PFA a 4% resulta em excelente coloração IHC se usado entre 16 h e 24 h a 4 ° C, com durações de fixação mais longas, resultando em aumento da coloração de fundo inespecífica e mascaramento de epítopos.

5. Remoção da lente

1. Na manhã seguinte, remova o olho do PFA a 4% em PBS e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Encha o prato com PBS para evitar que o olho seque.
2. Remova a lente.
   1. Comece segurando cuidadosamente a cápsula anterior do cristalino com uma pinça.
      NOTA: Tenha muito cuidado para não empurrar ou puxar com força a lente com a pinça, pois isso pode criar um descolamento de retina.
   2. Insira cuidadosamente a tesoura na câmara posterior com as lâminas curvadas posteriormente ao longo da lente. Faça um corte inicial nas zônulas da lente com uma tesoura curva.
      NOTA: Tenha muito cuidado para não empurrar ou puxar com força as zônulas com a tesoura, pois isso pode criar um descolamento de retina (Figura 1E).
   3. Continue a fazer pequenos cortes nas zônulas da lente em um padrão circunferencial. Faça de três a cinco cortes por hora.
   4. Para verificar se a lente está separada do resto do tecido, segure suavemente a cápsula anterior da lente com uma pinça e tente levantá-la suavemente. Se a lente não levantar imediatamente, não tente puxar mais, pois isso pode criar um descolamento de retina. Em vez disso, faça mais cortes nas zônulas restantes da lente e tente novamente.
   5. Depois de separado do resto do tecido, coloque o cristalino em solução de sacarose a 30% em RT para crioproteção ou descarte como acima. A crioproteção é completa quando a lente afunda, o que normalmente leva algumas horas.
3. Coloque o olho em pelo menos 50 mL de sacarose a 30% em PBS a 4 ° C para crioproteção. A crioproteção é completa quando o olho afunda, o que normalmente leva de 24 a 48 horas. Para acelerar a crioproteção, troque a solução inicial de sacarose por uma nova após 8-12 h e/ou mantenha o olho na solução de sacarose em RT.

6. Incorporação

1. Quando a crioproteção estiver completa, remova o olho da solução de sacarose a 30% e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Vire cuidadosamente o olho para que fique voltado para baixo para remover o excesso de solução de sacarose da parte interna do olho.
   NOTA: Não tente remover o excesso de solução da parte interna do olho com um lenço de laboratório, pois o lenço pode grudar no corpo vítreo e resultar em um descolamento de retina.
2. Com o olho voltado para baixo, limpe suavemente o excesso de solução de sacarose da parte externa do olho com um lenço.
3. Encha um molde de incorporação descartável com composto de temperatura de corte ideal (OCT) a uma profundidade de 0,5-1,0 cm.
   NOTA: Esta base garante que o olho não toque na parte inferior do molde, o que interfere na criossecção posterior.
4. Coloque o olho no molde de incorporação descartável voltado para cima. Encha lentamente a parte interna do olho com OCT, tomando cuidado especial para evitar a formação de bolhas dentro do olho. Se as bolhas se formarem, remova-as com cuidado ou empurre-as para a borda do molde usando uma pinça.
5. Termine de encher o molde de incorporação descartável com OCT. Certifique-se de que o olho esteja completamente submerso em OCT e não esteja tocando as superfícies internas do molde ou exposto ao ar. Enrole o molde de incorporação descartável contendo o olho em OCT em parafilme; colocar a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Em nossa experiência, períodos de incubação mais curtos não permitem que a OCT se infiltre completamente no vítreo. Como resultado, uma camada de sacarose geralmente permanece entre a retina e a OCT. Quando isso ocorre, a retina geralmente se desprende ou se desprende completamente do resto do tecido durante a criossecção, pois a sacarose congelada provavelmente fornece menos suporte estrutural do que a OCT congelada, dificultando ou mesmo impossibilitando a obtenção de seções de alta qualidade.
6. Na manhã seguinte, colocar o molde de inclusão contendo o olho na OCT em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Confirme se a membrana hialoide posterior parece levantada para cima da retina interna.
   NOTA: Este levantamento para cima pode obscurecer a visão da retina, dificultando a determinação da orientação.
7. Para determinar melhor a orientação do olho, segure cuidadosamente a membrana hialóide posterior anteriormente e tente retirá-la com uma pinça para expor a retina subjacente durante a OCT.
   NOTA: Às vezes, o canal hialóide pode ser visível, que se liga à cabeça do nervo óptico e pode ser usado para fins de orientação, uma vez que a cabeça do nervo óptico está localizada na porção superior da retina (Figura 2A). Não é necessário remover completamente a membrana hialóide posterior, pois a OCT já se infiltrou no corpo vítreo para revestir a retina interna e qualquer membrana remanescente não afetará a criossecção (Figura 2B). A membrana hialoide posterior só deve ser removida para orientação, se necessário. Outras opções para determinar a orientação incluem a colocação de uma sutura ou outro tipo de marca antes da enucleação.
8. Transfira o olho para um novo molde de incorporação com a nova OCT preenchida a uma profundidade de 0.5-1.0 cm e, em seguida, preencha com a nova OCT conforme as etapas 6.3-6.5 para garantir que o meio de incorporação final esteja livre de detritos e/ou outras imperfeições que possam ter se acumulado durante a noite. Se possível, remova suavemente a OCT com um pano de dentro do olho também, embora isso não seja necessário.
9. Rotule o molde para fins de orientação (Figura 2C). Orientar o olho com o olho voltado para cima no molde criogênico garante que a OCT revestirá a retina interna. O canal hialóide, que se liga à cabeça do nervo óptico, é um marco importante para determinar a parte superior do olho (Figura 2A).
10. Coloque o molde de incorporação rotulado contendo o olho em OCT em cima do gelo seco. Certifique-se de que o olho não esteja tocando em nenhuma das superfícies internas do molde de incorporação ou exposto ao ar. Certifique-se de que o molde esteja tocando diretamente o gelo seco para acelerar o processo de congelamento (Figura 2D).
11. Transferir o olhal embebido para um congelador a -80 °C ou directamente para o criostato para seccionamento (figura 2E).

7. Crioseccionamento

1. Monte o bloco com a parte superior do olho voltada para cima e a parte inferior do olho voltada para inferiormente, com a córnea e a íris restantes voltadas para a direita (como na Figura 2E) ou para a esquerda (não mostrada). Como alternativa, monte o bloco com uma orientação diferente, conforme desejado. Se necessário, quebre o molde para mobilizar o bloco, quebrando cuidadosamente cada lado do molde, um de cada vez, e marcando o bloco diretamente para não perder a orientação do olho.
2. Deixe o bloco se equilibrar à temperatura dentro do criostato por 30-60 min; -20 °C é um bom ponto de partida.
3. Uma vez montada, coloque uma lâmina nova no ângulo desejado, normalmente paralelo ao eixo vertical do olho.
4. Defina a espessura da seção conforme desejado: seções de 10-20 μm de espessura são um bom ponto de partida. Um exemplo de uma seção de 14 μm de espessura é demonstrado na Figura 3A-C.
   1. De maneira lenta e controlada, comece a seccionar o bloco. Certifique-se de que a lâmina está cortando o bloco paralelamente ao eixo vertical do olho. Caso contrário, ajuste o ângulo em que a lâmina entra em contato com o bloco ou a orientação do estágio de acordo.
   2. Ao seccionar o bloco, evite enrugar ou enrolar a seção com um pincel. Vire rapidamente a seção e aplique uma leve pressão para baixo com uma escova de pêlo comprido para achatar a seção e minimizar o enrugamento ou ondulação. Faça um pincel separado com uma ponta pontiaguda para ajudar na manipulação da seção.
5. Prenda a seção a uma lâmina de vidro carregada movendo lentamente a corrediça voltada para baixo em direção à seção. Evite que a seção se dobre sobre si mesma ou se distorça durante a fixação, rolando suavemente a lâmina de vidro sobre a seção.
   NOTA: Não passe o slide diretamente sobre a seção ou pressione-o contra a seção, pois isso pode danificar ou distorcer a seção.
6. Deixar as lâminas secarem durante a noite antes de as transferirem para um congelador a -80 °C ou de seguirem directamente para um protocolo de imunofluorescência normalizado.

Resultados

Após o processamento do tecido, um protocolo de imunofluorescência padrão pode ser utilizado para investigar qualquer número de processos biológicos dentro da retina. A Figura 3A-C ilustra imagens de fluorescência representativas de uma seção da retina obtidas por microscopia confocal. A secção retiniana foi imunomarcada de acordo com um protocolo previamente^descrito12.

As seções retinianas repr...

Discussão

Antes de implementar o protocolo acima, enfrentamos consistentemente dificuldades com o processamento tecidual de olhos de coelho para IHQ. Adaptamos vários protocolos dos olhos de animais menores, como camundongos, mas descobrimos que eles levavam a uma fixação inadequada e dificuldade de seccionamento do tecido. Existem várias considerações importantes que permitem seções consistentes e de alta qualidade da retina do coelho.

Uma consideração é o grande tamanho do globo do coelho e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)