Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi

Özet

Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.

Özet

Bu protokol, tavşanlar gibi daha büyük hayvanlarda yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonların nasıl elde edileceğini açıklar. Enükleasyondan sonra, göz kısa bir süre fiksatife daldırılır. Daha sonra kornea ve iris çıkarılır ve göz 4 °C'de ek fiksasyon için gece boyunca bırakılır. Sabitlemeyi takiben lens çıkarılır. Göz daha sonra bir kriyokalıba yerleştirilir ve bir gömme ortamı ile doldurulur. Lensi çıkararak, gömme ortamı vitreusa daha iyi erişebilir ve daha iyi retina stabilitesine yol açar. Daha da önemlisi, vitreus boyunca tam sızmaya izin vermek için göz gece boyunca gömme ortamında inkübe edilmelidir. Gece boyunca inkübasyondan sonra göz kuru buz üzerinde dondurulur ve kesitlere ayrılır. İmmünohistokimyada kullanılmak üzere tüm retina kesitleri elde edilebilir. Retina dokusu içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için standart boyama protokolleri kullanılabilir. Bu protokole uyulması, immünohistokimya kullanan herhangi bir deneyde kullanılabilecek yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonlar ile sonuçlanır.

Giriş

Retina, göz içinde ışığı nöral sinyallere dönüştürmek için birlikte çalışan birkaç özel hücre katmanından oluşur. Retina görmede kritik bir rol oynadığından, yapısını ve işlevini anlamak, diğerlerinin yanı sıra makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati gibi görme kaybının en yaygın nedenlerinden bazıları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Tavşanlar, diğer modellere kıyasla çeşitli avantajlar sundukları için retina araştırmalarında uygun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Tavşan gözleri anatomik olarak insan gözlerine nispeten benzer ^1,2. Örneğin, tavşanlar, insanlardaki foveaya benzer şekilde, yatay görsel çizgi olarak bilinen artmış bir fotoreseptör yoğunluğu alanına sahiptir. Kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan diğer hayvan modellerinin anatomik bir eşdeğeri yoktur. Ek olarak, kemirgenlerle karşılaştırıldığında, tavşanlardaki retina damar sistemi insanlardakine oldukça benzer. Tavşan gözleri de nispeten büyüktür. Bu, onları vitreus veya retina içinde ilaç uygulamasını veya cerrahi müdahaleyi içeren çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, aksi takdirde daha küçük bir gözde zor veya imkansız olabilir³.

İmmünohistokimya (IHC), bir doku içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir ^4,5,6. Retina hassas bir yapı olduğundan, IHC ile faydalı sonuçlar elde etmek dikkatli bir doku işlemi gerektirir. Retina dekolmanı ve retina kırılmaları veya kıvrımları gibi diğer doku artefaktları genellikle işleme sırasında ortaya çıkar ve sonuçların yorumlanmasını engelleyebilir. Başarılı işleme, doku manipülasyonu, fiksasyonun türü ve süresi, gömme ortamının türü ve kesit alma teknikleri ^7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Retina araştırmalarında tavşanların bir hayvan modeli olarak kullanılmasının avantajlarına rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu makale, IHC'de kullanılmak üzere bütün tavşan gözlerinden yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklamaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler, Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumlu olarak yürütülmüş ve onaylanmıştır. Bu protokolün geliştirilmesinde 4 ila 6 aylık yaşları arasında on dört (n = 14) Hollanda kuşaklı tavşan kullanılmıştır. Hem erkek hem de dişi hayvanlar kullanıldı. Tüm hayvanlar 2,0 ila 2,5 kg ağırlığındaydı. Bütün hayvanlar tek başına barındırıldı. Önerilen malzeme ve ekipmanların bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hazırlık

1. Fiksatif hazırlık.
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. En azından, göz başına 50 mL fiksatif gereklidir.
2. Kriyoprotektif ajan hazırlama.
   1. PBS'de hacimce ağırlıkça %30 (a/h) sükroz hazırlayın. Sükrozun tamamen çözüldüğünden emin olmak için en az 15 dakika çalkalayıcı üzerine koyun. En azından, göz başına 50 mL kriyoprotektif ajan gereklidir.
3. Diseksiyon aletinin hazırlanması.
   1. İki çift forseps, bir çift kavisli makas, bir neşter bıçağı ve 100 mm'lik bir diseksiyon kabı toplayın ve bunları bir diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Örnek bir kurulum Şekil 1A'da gösterilmiştir.

2. İlk fiksasyon

1. Trans-konjonktival enükleasyonun¹¹ ardından, gözü hemen buz üzerinde PBS'de en az 50 mL %4 PFA'ya yerleştirin. Gözün tamamen suya daldırıldığından emin olun. Gözün dış yüzeyinde hava kabarcıkları birikirse, hafifçe çalkalayarak çıkarın.

3. Kornea ve iris çıkarma

1. 15 dakika sonra, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.
2. Korneayı çıkarın.
   1. Alttaki yapıların kazara delinmesini önlemek için limbusun 1 mm önünde, iris düzlemine paralel bir cerrahi bıçakla bir kesi oluşturarak başlayın (Şekil 1B).
   2. İlk kesiğe kavisli makas sokun ve limbustan 1 mm uzakta kalarak çevresel olarak kesmeye devam edin. Keserken gözü stabilize etmek için forseps kullanın (Şekil 1C).
   3. Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, korneayı forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. Korneayı, kriyoproteksiyon veya atma için oda sıcaklığında (RT) %30 sükroz çözeltisine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, kornea battığında tamamlanır ve bu genellikle 1 saatten az sürer.
3. İrisi çıkarın.
   1. İris boyunca kavisli bir makasla ilk kesimi yaparak başlayın. Korneanın çıkarılmasına benzer şekilde çevresel olarak keserek irisi dokunun geri kalanından tamamen ayırın (Şekil 1D).
   2. Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, irisi forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. İrisi, kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, iris battığında tamamlanır ve bu genellikle 30 dakikadan az sürer.

4. Fiksasyonun tamamlanması

1. Kornea ve iris çıkarıldıktan sonra, gözü PBS'de en az 50 mL taze hazırlanmış% 4 PFA'ya yerleştirin ve hafif çalkalama için bir çalkalayıcıya koyun. Çalkalama sırasında gözün su altında kaldığından emin olun.
2. Gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 PFA'da gözünüzü koruyun.
   NOT: %4 PFA'nın, 4 ° C'de 16 saat ile 24 saat arasında kullanıldığında mükemmel IHC boyaması ile sonuçlandığını, daha uzun fiksasyon sürelerinin spesifik olmayan arka plan boyaması ve epitop maskelemesinin artmasına neden olduğunu bulduk.

5. Lensin çıkarılması

1. Ertesi sabah, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.
2. Lensi çıkarın.
   1. Ön lens kapsülünü forseps ile dikkatlice kavrayarak başlayın.
      NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, lensi forseps ile zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin.
   2. Makasları, bıçaklar lens boyunca arkaya doğru kıvrık olacak şekilde dikkatlice arka odaya yerleştirin. Kavisli makasla lens zonüllerinden ilk kesimi yapın.
      NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, zonülleri makasla zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin (Şekil 1E).
   3. Lens zonüllerinden çevresel bir düzende küçük kesikler yapmaya devam edin. Saat başına üç ila beş kesim yapın.
   4. Lensin dokunun geri kalanından ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için, ön lens kapsülünü forseps ile nazikçe kavrayın ve nazikçe kaldırmaya çalışın. Lens hemen kalkmazsa, retina dekolmanı oluşturabileceğinden daha fazla çekmeye çalışmayın. Bunun yerine, kalan lens zonüllerinden daha fazla kesi yapın ve yeniden deneyin.
   5. Dokunun geri kalanından ayrıldıktan sonra, lensi kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, lens battığında tamamlanır ve bu genellikle birkaç saat sürer.
3. Kriyoproteksiyon için gözü 4 ° C'de PBS'de en az 50 mL %30 sükroz içine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, göz battığında tamamlanır ve bu genellikle 24-48 saat sürer. Kriyoproteksiyonu hızlandırmak için, ilk sükroz solüsyonunu 8-12 saat sonra taze bir solüsyonla değiştirin ve/veya gözünüzü RT'de sakaroz solüsyonunda tutun.

6. Gömme

1. Kriyoproteksiyon tamamlandıktan sonra, gözü %30 sükroz solüsyonundan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün iç kısmındaki fazla sakaroz solüsyonunu çıkarmak için gözü aşağı bakacak şekilde dikkatlice çevirin.
   NOT: Mendil vitreus gövdesine yapışabileceğinden ve retina dekolmanı ile sonuçlanabileceğinden, gözün iç kısmındaki fazla solüsyonu laboratuvar mendiliyle çıkarmaya çalışmayın.
2. Göz aşağı bakacak şekilde, bir mendil kullanarak gözün dış kısmındaki fazla sükroz solüsyonunu nazikçe silin.
3. Tek kullanımlık bir gömme kalıbını 0,5-1,0 cm derinliğe kadar optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun.
   NOT: Bu taban, gözün kalıbın altına temas etmemesini sağlar, bu da daha sonra kriyoseksiyona müdahale eder.
4. Gözü yukarı bakacak şekilde tek kullanımlık gömme kalıbına yerleştirin. Göz içinde kabarcık oluşumunu önlemek için özel dikkat göstererek gözün iç kısmını yavaşça OCT ile doldurun. Kabarcıklar oluşursa, bunları dikkatlice çıkarın veya forseps kullanarak kalıbın kenarına itin.
5. Tek kullanımlık gömme kalıbını OCT ile doldurmayı bitirin. Gözün tamamen OCT'ye batırıldığından ve kalıbın iç yüzeylerine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Gözü OCT'de içeren tek kullanımlık gömme kalıbını parafilme sarın; gece boyunca 4 °C'ye koyun.
   NOT: Deneyimlerimize göre, daha kısa kuluçka süreleri OCT'nin vitreusa tamamen sızmasına izin vermez. Sonuç olarak, retina ile OCT arasında genellikle bir sükroz tabakası kalır. Bu meydana geldiğinde, donmuş sükroz muhtemelen donmuş OCT'den daha az yapısal destek sağladığından, kriyoseksiyon sırasında retina genellikle dokunun geri kalanından ayrılır veya tamamen yırtılır, bu da yüksek kaliteli kesitlerin elde edilmesini zorlaştırır ve hatta imkansız hale getirir.
6. Ertesi sabah, gözü OCT'de içeren gömme kalıbını diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Arka hyaloid zarın iç retinadan yukarı doğru kalkmış göründüğünü onaylayın.
   NOT: Bu yukarı kaldırma, retinanın görünümünü engelleyebilir ve yönün belirlenmesini zorlaştırabilir.
7. Gözün yönünü daha iyi belirlemek için, posterior hyaloid membranı öne doğru dikkatlice kavrayın ve OCT sırasında alttaki retinayı ortaya çıkarmak için forseps ile soymaya çalışın.
   NOT: Bazen, optik sinir kafasına yapışan ve optik sinir başı retinanın üst kısmında yer aldığından yönlendirme amacıyla kullanılabilen hyaloid kanal görülebilir (Şekil 2A). Posterior hyaloid membranın tamamen çıkarılması gerekli değildir, çünkü OCT iç retinayı hizalamak için vitreus gövdesine zaten sızmıştır ve kalan herhangi bir membran kriyoseksiyonu etkilemeyecektir (Şekil 2B). Posterior hyaloid membran sadece gerekirse oryantasyon için çıkarılmalıdır. Oryantasyonu belirlemek için diğer seçenekler arasında, enükleasyondan önce bir sütür veya başka bir tür işaret yerleştirilmesi yer alır.
8. Gözü 0,5-1,0 cm derinliğe kadar doldurulmuş yeni OCT ile yeni bir gömme kalıbına aktarın ve ardından son gömme ortamının kalıntı ve/veya gece boyunca birikmiş olabilecek diğer kusurlardan arınmış olduğundan emin olmak için 6.3-6.5 adımlarındaki gibi yeni OCT ile doldurun. Mümkünse, OCT'yi gözün içinden de bir mendille nazikçe çıkarın, ancak bu gerekli değildir.
9. Kalıbı oryantasyon amacıyla etiketleyin (Şekil 2C). Kriyo kalıbında göz yukarı bakacak şekilde gözü yönlendirmek, OCT'nin iç retinayı kaplamasını sağlar. Optik sinir başına yapışan hyaloid kanal, gözün üst kısmının belirlenmesinde önemli bir dönüm noktasıdır (Şekil 2A).
10. Gözü OCT olarak içeren etiketli gömme kalıbını kuru buzun üzerine yerleştirin. Gözün gömme kalıbının iç yüzeylerinden hiçbirine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Dondurma işlemini hızlandırmak için kalıbın doğrudan kuru buza temas ettiğinden emin olun (Şekil 2D).
11. Gömülü gözü -80 °C'lik bir dondurucuya veya kesit almak için doğrudan kriyostata aktarın (Şekil 2E).

7. Kriyoseksiyon

1. Bloğu, gözün üst kısmı üste ve gözün alt kısmı aşağıya bakacak şekilde, kalan kornea ve iris sağa ( Şekil 2E'deki gibi) veya sola (gösterilmemiştir) bakacak şekilde monte edin. Alternatif olarak, bloğu istediğiniz gibi farklı bir yönde monte edin. Gerekirse, kalıbın her iki tarafını birer birer dikkatlice kırarak ve gözün yönünü kaybetmemek için bloğu doğrudan işaretleyerek bloğu harekete geçirmek için kalıbı kırın.
2. Bloğun kriyostat içindeki sıcaklığa 30-60 dakika dengelenmesine izin verin; -20 °C iyi bir başlangıç noktasıdır.
3. Monte edildikten sonra, istenen açıda, tipik olarak gözün dikey eksenine paralel olarak yeni bir bıçak yerleştirin.
4. Kesit kalınlığını istediğiniz gibi ayarlayın: 10-20 μm kalınlığındaki kesitler iyi bir başlangıç noktasıdır. 14 μm kalınlığındaki bir kesit örneği Şekil 3A-C'de gösterilmiştir.
   1. Yavaş ve kontrollü bir şekilde, bloğu bölümlere ayırmaya başlayın. Bıçağın bloğu gözün dikey eksenine paralel olarak kestiğinden emin olun. Değilse, bıçağın bloğa temas açısını veya sahne yönünü buna göre ayarlayın.
   2. Bloğu bölümlere ayırırken, bölümün bir fırça ile kırışmasını veya kıvrılmasını önleyin. Bölümü hızlı bir şekilde ters çevirin ve bölümü düzleştirmek ve kırışmayı veya kıvrılmayı en aza indirmek için uzun tüylü bir fırça ile aşağı doğru hafif bir baskı uygulayın. Bölümün manipülasyonuna yardımcı olmak için sivri uçlu ayrı bir fırça oluşturun.
5. Slaytı aşağıya doğru bölüme doğru yavaşça hareket ettirerek bölümü yüklü bir cam slayta takın. Cam sürgüyü bölümün üzerinde hafifçe yuvarlayarak bölümün kendi üzerine katlanmasını veya takma sırasında başka bir şekilde kendini bozmasını önleyin.
   NOT: Slaytı doğrudan bölümün üzerine getirmeyin veya bölüme doğru bastırmayın, çünkü bu bölüme zarar verebilir veya deforme olabilir.
6. -80 °C'lik bir dondurucuya aktarmadan veya doğrudan standart bir immünofloresan protokolüne geçmeden önce slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin.

Sonuçlar

Doku işlemeden sonra, retina içindeki herhangi bir sayıda biyolojik süreci araştırmak için standart bir immünofloresan protokolü kullanılabilir. Şekil 3A-C, konfokal mikroskopi ile elde edilen bir retina bölümünün temsili floresan görüntülerini göstermektedir. Retina bölümü daha önce tarif edilen bir protokol^12'ye göre immün boyandı.

Şekil 3A-...

Tartışmalar

Yukarıdaki protokolü uygulamadan önce, IHC için tavşan gözlerinin doku işlemesinde sürekli olarak zorluklarla karşılaştık. Fareler gibi daha küçük hayvanların gözlerinden birkaç protokol uyarladık, ancak bunların yetersiz fiksasyona ve doku kesitinde zorluğa yol açtığını gördük. Tavşan retinasının tutarlı, yüksek kaliteli bölümlerine izin veren birkaç önemli husus vardır.

Dikkate alınması gereken bir husus, kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan di?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)