Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi

Özet

Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.

Özet

Bu protokol, tavşanlar gibi daha büyük hayvanlarda yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonların nasıl elde edileceğini açıklar. Enükleasyondan sonra, göz kısa bir süre fiksatife daldırılır. Daha sonra kornea ve iris çıkarılır ve göz 4 °C'de ek fiksasyon için gece boyunca bırakılır. Sabitlemeyi takiben lens çıkarılır. Göz daha sonra bir kriyokalıba yerleştirilir ve bir gömme ortamı ile doldurulur. Lensi çıkararak, gömme ortamı vitreusa daha iyi erişebilir ve daha iyi retina stabilitesine yol açar. Daha da önemlisi, vitreus boyunca tam sızmaya izin vermek için göz gece boyunca gömme ortamında inkübe edilmelidir. Gece boyunca inkübasyondan sonra göz kuru buz üzerinde dondurulur ve kesitlere ayrılır. İmmünohistokimyada kullanılmak üzere tüm retina kesitleri elde edilebilir. Retina dokusu içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için standart boyama protokolleri kullanılabilir. Bu protokole uyulması, immünohistokimya kullanan herhangi bir deneyde kullanılabilecek yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonlar ile sonuçlanır.

Giriş

Retina, göz içinde ışığı nöral sinyallere dönüştürmek için birlikte çalışan birkaç özel hücre katmanından oluşur. Retina görmede kritik bir rol oynadığından, yapısını ve işlevini anlamak, diğerlerinin yanı sıra makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati gibi görme kaybının en yaygın nedenlerinden bazıları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Tavşanlar, diğer modellere kıyasla çeşitli avantajlar sundukları için retina araştırmalarında uygun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Tavşan gözleri anatomik olarak insan gözlerine nispeten benzer ^1,2. Örneğin, tavşanlar, insanlardaki f....

Protokol

Tüm prosedürler, Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumlu olarak yürütülmüş ve onaylanmıştır. Bu protokolün geliştirilmesinde 4 ila 6 aylık yaşları arasında on dört (n = 14) Hollanda kuşaklı tavşan kullanılmıştır. Hem erkek hem de dişi hayvanlar kullanıldı. Tüm hayvanlar 2,0 ila 2,5 kg ağırlığındaydı. Bütün hayvanlar tek başına barındırıldı. Önerilen malzeme ve ekipmanların bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hazırlık

1. Fiksatif hazırlık.
   1. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. En azından, göz baş....

Tartışmalar

Yukarıdaki protokolü uygulamadan önce, IHC için tavşan gözlerinin doku işlemesinde sürekli olarak zorluklarla karşılaştık. Fareler gibi daha küçük hayvanların gözlerinden birkaç protokol uyarladık, ancak bunların yetersiz fiksasyona ve doku kesitinde zorluğa yol açtığını gördük. Tavşan retinasının tutarlı, yüksek kaliteli bölümlerine izin veren birkaç önemli husus vardır.

Dikkate alınması gereken bir husus, kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan di?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)