مراقبة التطور الميكانيكي للأنسجة أثناء إغلاق الأنبوب العصبي لجنين الفرخ

Summary

تم تطوير هذا البروتوكول لمراقبة الخصائص الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية طوليا أثناء تعصيب جنين الفرخ. يعتمد على دمج مجهر بريلوين ونظام حضانة على خشبة المسرح ، مما يتيح التصوير الميكانيكي الحي لأنسجة الصفيحة العصبية في أجنة الكتاكيت المستزرعة خارج البويضات .

Abstract

إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) هو عملية حاسمة أثناء التطور الجنيني. يمكن أن يؤدي الفشل في هذه العملية إلى عيوب الأنبوب العصبي ، مما يسبب تشوهات خلقية أو حتى الوفيات. يتضمن NTC سلسلة من الآليات على المستويات الوراثية والجزيئية والميكانيكية. في حين أن التنظيم الميكانيكي أصبح موضوعا جذابا بشكل متزايد في السنوات الأخيرة ، إلا أنه لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير بسبب عدم وجود تقنية مناسبة لإجراء الاختبارات الميكانيكية للأنسجة الجنينية 3D في الموقع. استجابة لذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لتحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية للدجاج بطريقة غير ملامسة وغير جراحية. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج مجهر بريلوين متحد البؤر مع نظام حضانة على المسرح. لفحص ميكانيكا الأنسجة ، يتم جمع جنين مزروع مسبقا ونقله إلى حاضنة على خشبة المسرح لزراعة البويضات السابقة . في الوقت نفسه ، يتم الحصول على الصور الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية بواسطة مجهر بريلوين في نقاط زمنية مختلفة أثناء التطوير. يتضمن هذا البروتوكول وصفا مفصلا لإعداد العينات ، وتنفيذ تجارب الفحص المجهري Brillouin ، والمعالجة اللاحقة للبيانات وتحليلها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين دراسة التطور الميكانيكي للأنسجة الجنينية أثناء التطور طوليا.

Introduction

عيوب الأنبوب العصبي (NTDs) هي عيوب خلقية شديدة في الجهاز العصبي المركزي ناتجة عن الفشل في إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) أثناء التطور الجنيني¹. مسببات أمراض المناطق المدارية المهملة معقدة. أظهرت الدراسات أن NTC ينطوي على سلسلة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك التمديد المتقارب ، وثني الصفيحة العصبية (على سبيل المثال ، الانقباض القمي) ، ورفع الطية العصبية ، وأخيرا التصاق الطية العصبية. وتنظم هذه العمليات آليات جزيئية وجينية متعددة ^2,3، وأي خلل في هذه العمليات قد يؤدي إلى أمراض المناطق المدارية المهملة ^4,5,6<....

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة واين ستيت.

1. التحضير التجريبي

1. استخدم محلول إيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف وتعقيم المقص والملاقط. أيضا ، إعداد ماصات يمكن التخلص منها وحقنة.
2. قم بإعداد وسط غسيل بإضافة 3.595 جم من كلوريد الصوديوم إلى 495 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم أضف 5 مل من البنسلين والستربتومايسين (5 وحدة / مل) إلى الوسط. املأ طبق بتري 100 مم بوسط الغسيل وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
3. قم بإعداد أطباق الاستزراع وفقا للشكل 1 ، الذي يوضح التكوين العام.
   1. قم بإعداد قطعة من ورق الترشيح ، وقم بتقطيعها إلى شكل مستطيل يبلغ حوالي....

النتائج

يوضح الشكل 6 الرسم التخطيطي لمجهر بريلوين. يستخدم النظام ليزر 660 نانومتر كمصدر للضوء. يتم وضع عازل مباشرة بعد رأس الليزر لرفض أي ضوء منعكس من الخلف ، ويتم استخدام مرشح الكثافة المحايدة (ND) لضبط طاقة الليزر. يتم استخدام زوج من العدسات ، L1 و L2 ، بأطوال بؤرية f1 = 16 مم و f2 = 100 مم ، عل?.......

Discussion

يمكن أن يتأثر التطور المبكر للجنين بسهولة بالاضطرابات الخارجية. لذلك ، يجب توخي أقصى درجات الحذر أثناء استخراج العينة ونقلها. إحدى المشكلات المحتملة هي انفصال الجنين عن ورقة الترشيح ، مما قد يؤدي إلى تقلص غشاء vitelline ويؤدي إلى قطعة أثرية مائلة من اللوحة العصبية في تصوير Brillouin. علاوة على ذلك .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set