Мониторинг механической эволюции тканей при закрытии нервной трубки эмбриона цыпленка

Резюме

Данный протокол был разработан для лонгитюдного мониторинга механических свойств ткани нервной пластинки при нейруляции эмбриона цыпленка. Он основан на интеграции микроскопа Бриллюэна и инкубационной системы на сцене, что позволяет получать механическую визуализацию тканей нервной пластинки в эмбрионах цыплят, культивируемых ex ovo .

Аннотация

Закрытие нервной трубки (NTC) является критически важным процессом во время эмбрионального развития. Сбой в этом процессе может привести к дефектам нервной трубки, вызывая врожденные пороки развития или даже смерть. NTC включает в себя ряд механизмов на генетическом, молекулярном и механическом уровнях. Несмотря на то, что механическое регулирование становится все более привлекательной темой в последние годы, оно остается в значительной степени неизученным из-за отсутствия подходящей технологии для проведения 3D-тестирования эмбриональной ткани in situ. В ответ на это мы разработали протокол количественной оценки механических свойств эмбриональной ткани курицы бесконтактным и неинвазивным способом. Это достигается за счет интеграции конфокального микроскопа Бриллюэна с инкубационной системой на сцене. Для исследования механики тканей предварительно культивируемый эмбрион отбирают и переносят в инкубатор на сцене для культивирования ex ovo . Одновременно с помощью микроскопа Бриллюэна с помощью микроскопа Бриллюэна получаются механические изображения ткани нервной пластинки в разные моменты времени. Этот протокол включает в себя подробное описание пробоподготовки, проведения экспериментов по микроскопии Бриллюэна, а также постобработки и анализа данных. Следуя этому протоколу, исследователи могут изучать механическую эволюцию эмбриональной ткани во время развития в продольном направлении.

Введение

Дефекты нервной трубки (ДНТ) – это тяжелые врожденные дефекты центральной нервной системы, вызванные сбоями в закрытии нервной трубки (NTC) во время эмбрионального развития¹. Этиология ДНТ сложна. Исследования показали, что NTC включает в себя последовательность морфогенетических процессов, включая конвергентное расширение, изгиб нервной пластинки (например, апикальное сужение), поднятие нервной складки и, наконец, адгезию нервной складки. Эти процессы регулируются множественными молекулярно-генетическими механизмами ^2,3, и любой сбой в этих процессах может привест....

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Государственного университета Уэйна.

1. Подготовка эксперимента

1. Используйте 70% раствор этанола для очистки и стерилизации ножниц и пинцета. Также подготовьте одноразовые пипетки и шприц.
2. Приготовьте промывное средство, добавив 3,595 г NaCl к 495 мл деионизированной воды. Затем добавьте в среду 5 мл пенициллина-стрептомицина (5 ЕД/мл). Наполните 100-миллиметровую чашку Петри промывочным средством и нагрейте ее до 37 °C.
3. Приготовьте культурную посуду в соответствии с рисунком 1, который иллюстри....

Результаты

На рисунке 6 показана схема микроскопа Бриллюэна. В качестве источника света используется лазер с длиной волны 660 нм. Изолятор размещается сразу после лазерной головки, чтобы отклонять любой отраженный назад свет, а фильтр нейтральной плотности (ND) используется для регу?.......

Обсуждение

На раннее развитие эмбриона легко могут повлиять внешние нарушения. Поэтому при извлечении и переносе проб требуется предельная осторожность. Одной из потенциальных проблем является отслоение эмбриона от фильтровальной бумаги, что может привести к уменьшению вителлиновой мембраны и.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set