监测雏鸡胚胎神经管闭合过程中组织的机械进化

摘要

该协议旨在纵向监测雏鸡胚胎神经形成过程中神经板组织的机械性能。它基于布里渊显微镜和载物台孵化系统的集成，能够对 卵 培养雏鸡胚胎中的神经板组织进行实时机械成像。

摘要

神经管闭合（NTC）是胚胎发育过程中的关键过程。这一过程的失败会导致神经管缺陷，导致先天性畸形甚至死亡。NTC涉及遗传、分子和机械水平的一系列机制。虽然近年来机械调节已成为一个越来越有吸引力的话题，但由于缺乏合适的技术来 对原位进行 3D 胚胎组织的机械测试，它在很大程度上仍未得到探索。作为回应，我们开发了一种以非接触式和非侵入性方式量化鸡胚胎组织的机械性能的方案。这是通过将共聚焦布里渊显微镜与载物台孵育系统集成来实现的。为了探究组织力学，收集预培养的胚胎并将其转移到载物台培养箱中进行 卵外 培养。同时，布里渊显微镜在发育过程中的不同时间点采集神经板组织的机械图像。该协议包括样品制备的详细说明、布里渊显微镜实验的实施以及数据后处理和分析。通过遵循该协议，研究人员可以纵向研究胚胎组织在发育过程中的机械进化。

引言

神经管缺陷 （NTD） 是胚胎发育过程中神经管闭合 （NTC） 失败引起的严重中枢神经系统出生缺陷¹。被忽视的热带病的病因很复杂。研究表明，NTC 涉及一系列形态发生过程，包括收敛延伸、神经板弯曲（例如，顶端收缩）、神经皱襞抬高以及最终神经襞的粘附。这些过程受多种分子和遗传机制^的调节^2,3，^这些过程中的任何故障都可能导致NTDs4,5,6。随着越来越多的证据表明，机械线索在 NTC^{3、7、8、9、10、11} 中也起着至关重要的作用，并且已经发现了基因和机械线索^{之间的关系} 12,13,14，因此研究神经形....

研究方案

该协议已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1.实验准备

1. 使用70%乙醇溶液清洁和消毒剪刀和镊子。此外，准备一次性移液器和注射器。
2. 通过向 495 mL 去离子水中加入 3.595 g NaCl 来制备洗涤介质。然后，向培养基中加入5ml青霉素 - 链霉素（5U / mL）。用洗涤介质填充100毫米培养皿并将其加热至37°C。
3. 根据 图 1 准备培养皿，图 1 说明了整体配置。
   1. 准备一张滤纸，将其切成大约 17 毫米× 20 毫米的矩形，然后去掉四个角。在滤纸上创建一个中空中心，大小约为7毫米×10毫米，用于固定胚胎（图1，左）。
      注意：胚胎的收集在步骤2中描述。
   2. 将市售环（Φ = 1 英寸，参见 材料表）与柔性薄膜（即石蜡薄膜）层连接，确保柔性薄膜也具有空心。这个带有薄膜的环将用于固定带有胚胎的滤纸。
   3. 最后，将准备好的环放入35毫米培养皿中（图1，右）。
      注意：滤纸用于通过将滤纸放在膜上并将胚胎留在中心空心区域（将在步骤 2 中详细介绍）来固定和保持提取的胚胎。四个角被切割成适合外环的尺寸....

讨论

胚胎的早期发育很容易受到外界干扰的影响。因此，在样品提取和转移过程中需要格外小心。一个潜在的问题是胚胎从滤纸上脱落，这可能导致卵黄膜收缩，并导致布里渊成像中神经板的倾斜伪影。此外，这种收缩可能会阻止胚胎的发育。应注意防止分离的几个关键步骤。首先，在步骤2.4中，确保从膜表面彻底去除蛋白至关重要。任何残留的蛋白都会阻碍膜与滤纸^46,47

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set