Monitorización de la evolución mecánica del tejido durante el cierre del tubo neural de un embrión de pollo

Resumen

Este protocolo se desarrolló para monitorizar longitudinalmente las propiedades mecánicas del tejido de la placa neural durante la neurulación del embrión de pollo. Se basa en la integración de un microscopio Brillouin y un sistema de incubación en el escenario, lo que permite obtener imágenes mecánicas en vivo del tejido de la placa neural en embriones de pollo cultivados ex ovo .

Resumen

El cierre del tubo neural (NTC) es un proceso crítico durante el desarrollo embrionario. El fallo en este proceso puede dar lugar a defectos del tubo neural, causando malformaciones congénitas o incluso la mortalidad. La NTC involucra una serie de mecanismos a nivel genético, molecular y mecánico. Si bien la regulación mecánica se ha convertido en un tema cada vez más atractivo en los últimos años, sigue siendo en gran medida inexplorado debido a la falta de tecnología adecuada para realizar pruebas mecánicas de tejido embrionario 3D in situ. En respuesta, hemos desarrollado un protocolo para cuantificar las propiedades mecánicas del tejido embrionario de pollo de una manera no invasiva y sin contacto. Esto se logra mediante la integración de un microscopio confocal de Brillouin con un sistema de incubación en el escenario. Para sondear la mecánica de los tejidos, se recolecta un embrión precultivado y se transfiere a una incubadora en el escenario para el cultivo ex ovo . Simultáneamente, las imágenes mecánicas del tejido de la placa neural son adquiridas por el microscopio de Brillouin en diferentes momentos durante el desarrollo. Este protocolo incluye descripciones detalladas de la preparación de las muestras, la implementación de experimentos de microscopía de Brillouin y el posprocesamiento y análisis de datos. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden estudiar longitudinalmente la evolución mecánica del tejido embrionario durante el desarrollo.

Introducción

Los defectos del tubo neural (DTN) son defectos congénitos graves del sistema nervioso central causados por fallos en el cierre del tubo neural (NTC) durante^{el desarrollo} embrionario. La etiología de las enfermedades tropicales desatendidas es compleja. Los estudios han demostrado que el NTC implica una secuencia de procesos morfogenéticos, que incluyen la extensión convergente, la flexión de la placa neural (por ejemplo, la constricción apical), la elevación del pliegue neural y, finalmente, la adhesión del pliegue neural. Estos procesos están regulados por múltiples mecanismos moleculares y genéti....

Protocolo

El protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Wayne.

1. Preparación experimental

1. Use una solución de etanol al 70% para limpiar y esterilizar las tijeras y pinzas. Además, prepare pipetas desechables y una jeringa.
2. Prepare un medio de lavado añadiendo 3,595 g de NaCl a 495 ml de agua desionizada. A continuación, añadir 5 ml de penicilina-estreptomicina (5 U/mL) al medio. Llene una placa de Petri de 100 mm con el medio de lavado y caliéntela a 37 °C.
3. Prepare platos de cultivo de acuerdo con la Figura 1

Discusión

El desarrollo temprano del embrión puede verse fácilmente afectado por alteraciones externas. Por lo tanto, se requiere la máxima precaución durante la extracción y transferencia de muestras. Un problema potencial es el desprendimiento del embrión del papel de filtro, lo que puede conducir a la contracción de la membrana vitelina y dar lugar a un artefacto inclinado de la placa neural en las imágenes de Brillouin. Además, este encogimiento puede detener el desarrollo del embrión. Se debe prestar atención a var.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set