Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Özet

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Özet

Nöral tüp kapanması (NTC), embriyonik gelişim sırasında kritik bir süreçtir. Bu süreçteki başarısızlık, nöral tüp defektlerine yol açarak konjenital malformasyonlara ve hatta mortaliteye neden olabilir. NTC, genetik, moleküler ve mekanik seviyelerde bir dizi mekanizma içerir. Mekanik düzenleme son yıllarda giderek daha çekici bir konu haline gelse de, 3D embriyonik dokunun yerinde mekanik testini yapmak için uygun teknolojinin bulunmaması nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş durumda. Buna cevaben, tavuk embriyonik dokusunun mekanik özelliklerini temassız ve invaziv olmayan bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Bu, konfokal bir Brillouin mikroskobunun sahnede bir inkübasyon sistemi ile entegre edilmesiyle elde edilir. Doku mekaniğini araştırmak için, önceden kültürlenmiş bir embriyo toplanır ve ex ovo kültür için sahnedeki bir inkübatöre aktarılır. Eşzamanlı olarak, nöral plak dokusunun mekanik görüntüleri, gelişim sırasında farklı zaman noktalarında Brillouin mikroskobu tarafından elde edilir. Bu protokol, numune hazırlama, Brillouin mikroskobu deneylerinin uygulanması ve veri işleme sonrası ve analizinin ayrıntılı açıklamalarını içerir. Bu protokolü izleyerek, araştırmacılar gelişim sırasında embriyonik dokunun mekanik evrimini uzunlamasına inceleyebilirler.

Giriş

Nöral tüp defektleri (NTD'ler), embriyonik gelişim sırasında nöral tüp kapanmasındaki (NTC) başarısızlıkların neden olduğu merkezi sinir sisteminin ciddi doğum kusurlarıdır¹. NTD'lerin etiyolojisi karmaşıktır. Çalışmalar, NTC'nin yakınsak uzantı, nöral plakanın bükülmesi (örneğin, apikal daralma), nöral kıvrımın yükseltilmesi ve son olarak nöral kıvrımın yapışması dahil olmak üzere bir dizi morfogenetik süreci içerdiğini göstermiştir. Bu süreçler çoklu moleküler ve genetik mekanizmalar ^2,3 tarafından düzenlenir ve bu süreçlerdeki herhangi bir arıza NTD'lere ^4,....

Protokol

Protokol, Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Deneysel hazırlık

1. Makas ve cımbızı temizlemek ve sterilize etmek için %70 etanol solüsyonu kullanın. Ayrıca, tek kullanımlık pipetler ve bir şırınga hazırlayın.
2. 495 mL deiyonize suya 3.595 g NaCl ekleyerek bir yıkama ortamı hazırlayın. Daha sonra ortama 5 ml Penisilin-Streptomisin (5 U/mL) ekleyin. 100 mm'lik bir Petri kabını yıkama ortamıyla doldurun ve 37 °C'ye ısıtın.
3. Genel konfigürasyonu gösteren Şekil 1'e göre kültür kapları hazırlayın.
   1. Bir parça filtr....

Tartışmalar

Embriyonun erken gelişimi dış rahatsızlıklardan kolayca etkilenebilir. Bu nedenle, numune ekstraksiyonu ve transferi sırasında çok dikkatli olunmalıdır. Potansiyel bir sorun, embriyonun filtre kağıdından ayrılmasıdır, bu da vitellin zarının büzülmesine yol açabilir ve Brillouin görüntülemede nöral plakanın eğik bir artefaktına neden olabilir. Ayrıca, bu küçülme embriyonun gelişimini durdurabilir. Ayrılmayı önlemek için birkaç kritik adıma dikkat edilmelidir. İlk olarak, adım 2.4't.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set