Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften des Neuralplattengewebes während der Neurulation des Hühnerembryos im Längsschnitt zu überwachen. Es basiert auf der Integration eines Brillouin-Mikroskops und eines Inkubationssystems auf der Bühne und ermöglicht die mechanische Live-Bildgebung von Neuralplattengewebe in Ex-Ovo-kultivierten Kükenembryonen.

Zusammenfassung

Der Neuralrohrverschluss (NTC) ist ein kritischer Prozess während der Embryonalentwicklung. Ein Versagen in diesem Prozess kann zu Neuralrohrdefekten führen, die angeborene Fehlbildungen oder sogar den Tod verursachen. NTC umfasst eine Reihe von Mechanismen auf genetischer, molekularer und mechanischer Ebene. Während die mechanische Regulation in den letzten Jahren zu einem immer attraktiveren Thema geworden ist, bleibt es aufgrund des Mangels an geeigneter Technologie für die mechanische Prüfung von 3D-embryonalem Gewebe in situ weitgehend unerforscht. Als Reaktion darauf haben wir ein Protokoll entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften von embryonalem Gewebe von Hühnern berührungslos und nicht-invasiv zu quantifizieren. Dies wird durch die Integration eines konfokalen Brillouin-Mikroskops mit einem Inkubationssystem auf der Bühne erreicht. Um die Gewebemechanik zu untersuchen, wird ein vorkultivierter Embryo entnommen und in einen Inkubator auf der Bühne für die Ex-Ovo-Kultur überführt. Gleichzeitig werden die mechanischen Bilder des Neuralplattengewebes vom Brillouin-Mikroskop zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung aufgenommen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der Probenvorbereitung, der Durchführung von Brillouin-Mikroskopie-Experimenten sowie der Datennachbearbeitung und -analyse. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die mechanische Entwicklung des embryonalen Gewebes während der Entwicklung in Längsrichtung untersuchen.

Einleitung

Neuralrohrdefekte (NTDs) sind schwere Geburtsfehler des zentralen Nervensystems, die durch Störungen des Neuralrohrverschlusses (NTC) während der Embryonalentwicklung verursacht^{werden 1}. Die Ätiologie von NTDs ist komplex. Studien haben gezeigt, dass NTC eine Abfolge morphogenetischer Prozesse beinhaltet, einschließlich konvergenter Ausdehnung, Biegung der Neuralplatte (z. B. apikale Verengung), Anhebung der Neuralfalte und schließlich Adhäsion der Neuralfalte. Diese Prozesse werden durch mehrere molekulare und genetische Mechanismen reguliert ^2,3, und jede Fehlfun....

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wayne State University genehmigt.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Verwenden Sie eine 70%ige Ethanollösung, um die Schere und Pinzette zu reinigen und zu sterilisieren. Bereiten Sie außerdem Einwegpipetten und eine Spritze vor.
2. Bereiten Sie ein Waschmedium vor, indem Sie 3,595 g NaCl zu 495 ml deionisiertem Wasser geben. Geben Sie dann 5 ml Penicillin-Streptomycin (5 U/ml) in das Medium. Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit dem Waschmedium und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
3. Bereiten Sie Kulturschalen gemäß

Diskussion

Die frühe Entwicklung des Embryos kann leicht durch äußere Störungen beeinträchtigt werden. Daher ist bei der Probenentnahme und dem Transfer äußerste Vorsicht geboten. Ein potenzielles Problem ist die Ablösung des Embryos vom Filterpapier, was zum Schrumpfen der Vitellinmembran und zu einem gekippten Artefakt der Neuralplatte in der Brillouin-Bildgebung führen kann. Darüber hinaus kann diese Schrumpfung die Entwicklung des Embryos stoppen. Es sollte auf mehrere kritische Schritte geachtet werden, um eine Ablö.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set