A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية الدورية المتعددة بالكشف في الموقع عن علامات متعددة في وقت واحد باستخدام حضانة الأجسام المضادة المستضدية المتكررة ، ومسح الصور ، ومحاذاة الصورة وتكاملها. هنا ، نقدم بروتوكول التشغيل لتحديد ركائز الخلايا المناعية بهذه التقنية في سرطان الرئة وعينات ورم خبيث في الدماغ المقترن.

Abstract

تتضمن البيئة المكروية للورم تفاعلات بين الخلايا المضيفة والخلايا السرطانية والخلايا المناعية والخلايا اللحمية والأوعية الدموية. يعد توصيف المجموعات الفرعية للخلايا المناعية والبروتينات المستهدفة وتنظيمها مكانيا أمرا بالغ الأهمية للأغراض التنبؤية والعلاجية. وقد أدى ذلك إلى تطوير طرق تلطيخ الكيمياء المناعية المتعددة. تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية متعددة التألق بالكشف المتزامن عن علامات متعددة ، مما يسهل الفهم الشامل لوظيفة الخلية والتفاعلات بين الخلايا. في هذه الورقة ، نصف سير عمل لمقايسة الكيمياء المناعية الفلورية الدورية المتعددة وتطبيقها في التحليل الكمي للمجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية. يتبع تلطيخ الكيمياء المناعية الفلورية الحلقية المتعددة خطوات وكواشف مماثلة للكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، بما في ذلك استرجاع المستضد ، وحضانة الأجسام المضادة الدورية ، والتلوين على شريحة نسيج مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين (FFPE). أثناء تفاعل المستضد والجسم المضاد ، يتم تحضير خليط من الأجسام المضادة من أنواع مختلفة. يتم تحسين الظروف ، مثل وقت استرجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة ، والتحقق من صحتها لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه التقنية قابلة للتكرار وتعمل كأداة قيمة لأبحاث العلاج المناعي والتطبيقات السريرية.

Introduction

تمثل نقائل الدماغ (BM) أكثر أورام الجهاز العصبي المركزي شيوعا (CNS) ، والتي تحدث في ما يقرب من نصف حالات سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ، مع سوء التشخيص1. ما يقدر بنحو 10٪ -20٪ من مرضى NSCLC لديهم بالفعل BM في وقت التشخيص الأولي ، وحوالي 40٪ من حالات NSCLC ستتطور BM أثناء العلاج2. ترتبط البيئة المكروية للورم (TME) ارتباطا وثيقا بحدوث NSCLC و BM ، بما في ذلك المكونات المختلفة ، مثل الأوعية الدموية ، والخلايا الليفية ، والبلاعم ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا المناعية اللمفاوية ، والخلايا المناعية المشتقة من نخاع العظام ، وجزيئات الإشارة 3,4. ت....

Protocol

تمت الموافقة على البحث من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى يونان للسرطان / المستشفى الثالث التابع لجامعة كونمينغ الطبية. وقع جميع الأشخاص / الأوصياء القانونيين على الموافقة المستنيرة.

1. إعداد الشرائح

  1. قطع أجزاء من كتل البارافين المقترنة التي تحتوي على ورم رئوي أولي أو خلايا نقائل دماغية لسرطان الرئة بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بإزالة الأقسام إلى الماء وفصلها بملاقط ، واختر أفضلها وألصقها على الشريحة المطلية بالبوليسين.
  2. ضع شرائح المناديل الورقية في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز التصاق الأنسجة.
  3. اغمر الشرائح في الزيلين من خلال ثلاثة تغييرات ، يدوم كل منها لمدة 10....

النتائج

نقدم بروتوكولا للكشف عن المستضد الدوري باستخدام مضان متعدد الإرسال مكون من 5 ألوان على شريحة واحدة. من خلال تحسيننا للفحص ، نمكن حضانة جسمين مضادين من أنواع مختلفة (الشكل 1). تشمل الأجهزة اللازمة لإجراء التجربة طنجرة ضغط وصندوق تلطيخ مناعي (الشكل 2 أ).

Discussion

لقد وصفنا عملية تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة. يعد اختيار الأجسام المضادة الأولية جانبا مهما من مقايسة الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، ويوصى باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لتحسين الخصوصية والتكرار. لتحسين تركيز العمل للجسم المضاد ال.......

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81860413 ، 81960455) ، صندوق قسم العلوم والتكنولوجيا في يوننان (202001AY070001-080) ، مؤسسة البحث العلمي التابعة لإدارة التعليم في مقاطعة يوننان (2019J1274).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x sodium citrate Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% hydrogen peroxideMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond primary antibody diluentLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd. kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
ethanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS(powder)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
slide viwer 3D histech Ltd
xyleneSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10023418

References

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved