الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة

Summary

تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية الدورية المتعددة بالكشف في الموقع عن علامات متعددة في وقت واحد باستخدام حضانة الأجسام المضادة المستضدية المتكررة ، ومسح الصور ، ومحاذاة الصورة وتكاملها. هنا ، نقدم بروتوكول التشغيل لتحديد ركائز الخلايا المناعية بهذه التقنية في سرطان الرئة وعينات ورم خبيث في الدماغ المقترن.

Abstract

تتضمن البيئة المكروية للورم تفاعلات بين الخلايا المضيفة والخلايا السرطانية والخلايا المناعية والخلايا اللحمية والأوعية الدموية. يعد توصيف المجموعات الفرعية للخلايا المناعية والبروتينات المستهدفة وتنظيمها مكانيا أمرا بالغ الأهمية للأغراض التنبؤية والعلاجية. وقد أدى ذلك إلى تطوير طرق تلطيخ الكيمياء المناعية المتعددة. تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية متعددة التألق بالكشف المتزامن عن علامات متعددة ، مما يسهل الفهم الشامل لوظيفة الخلية والتفاعلات بين الخلايا. في هذه الورقة ، نصف سير عمل لمقايسة الكيمياء المناعية الفلورية الدورية المتعددة وتطبيقها في التحليل الكمي للمجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية. يتبع تلطيخ الكيمياء المناعية الفلورية الحلقية المتعددة خطوات وكواشف مماثلة للكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، بما في ذلك استرجاع المستضد ، وحضانة الأجسام المضادة الدورية ، والتلوين على شريحة نسيج مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين (FFPE). أثناء تفاعل المستضد والجسم المضاد ، يتم تحضير خليط من الأجسام المضادة من أنواع مختلفة. يتم تحسين الظروف ، مثل وقت استرجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة ، والتحقق من صحتها لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه التقنية قابلة للتكرار وتعمل كأداة قيمة لأبحاث العلاج المناعي والتطبيقات السريرية.

Introduction

تمثل نقائل الدماغ (BM) أكثر أورام الجهاز العصبي المركزي شيوعا (CNS) ، والتي تحدث في ما يقرب من نصف حالات سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ، مع سوء التشخيص¹. ما يقدر بنحو 10٪ -20٪ من مرضى NSCLC لديهم بالفعل BM في وقت التشخيص الأولي ، وحوالي 40٪ من حالات NSCLC ستتطور BM أثناء العلاج². ترتبط البيئة المكروية للورم (TME) ارتباطا وثيقا بحدوث NSCLC و BM ، بما في ذلك المكونات المختلفة ، مثل الأوعية الدموية ، والخلايا الليفية ، والبلاعم ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا المناعية اللمفاوية ، والخلايا المناعية المشتقة من نخاع العظام ، وجزيئات الإشارة ^3,4. ت....

Protocol

تمت الموافقة على البحث من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى يونان للسرطان / المستشفى الثالث التابع لجامعة كونمينغ الطبية. وقع جميع الأشخاص / الأوصياء القانونيين على الموافقة المستنيرة.

1. إعداد الشرائح

1. قطع أجزاء من كتل البارافين المقترنة التي تحتوي على ورم رئوي أولي أو خلايا نقائل دماغية لسرطان الرئة بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بإزالة الأقسام إلى الماء وفصلها بملاقط ، واختر أفضلها وألصقها على الشريحة المطلية بالبوليسين.
2. ضع شرائح المناديل الورقية في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز التصاق الأنسجة.
3. اغمر الشرائح في الزيلين من خلال ثلاثة تغييرات ، يدوم كل منها لمدة 10....

النتائج

نقدم بروتوكولا للكشف عن المستضد الدوري باستخدام مضان متعدد الإرسال مكون من 5 ألوان على شريحة واحدة. من خلال تحسيننا للفحص ، نمكن حضانة جسمين مضادين من أنواع مختلفة (الشكل 1). تشمل الأجهزة اللازمة لإجراء التجربة طنجرة ضغط وصندوق تلطيخ مناعي (الشكل 2 أ).

Discussion

لقد وصفنا عملية تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة. يعد اختيار الأجسام المضادة الأولية جانبا مهما من مقايسة الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، ويوصى باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لتحسين الخصوصية والتكرار. لتحسين تركيز العمل للجسم المضاد ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418