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  • 開示事項
  • 謝辞
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  • 転載および許可

要約

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ で検出することができます。ここでは、肺癌および対の脳転移サンプルにおいて、この技術を用いて免疫細胞の基質を同定するための操作プロトコルを紹介します。

要約

腫瘍微小環境には、宿主細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞、および血管系の間の相互作用が含まれます。免疫細胞のサブセットと標的タンパク質を特徴づけ、空間的に組織化することは、予後および治療の目的にとって非常に重要です。これにより、マルチプレックス免疫組織化学染色法が開発されました。マルチプレックス蛍光免疫組織化学は、複数のマーカーの同時検出を可能にし、細胞機能と細胞間相互作用の包括的な理解を促進します。この論文では、マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学アッセイのワークフローと、リンパ球サブセットの定量分析におけるその応用について説明します。マルチプレックス環状蛍光免疫組織化学染色は、抗原賦活化、環状抗体インキュベーション、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織スライドでの染色など、標準的な免疫組織化学と同様の手順と試薬に従います。抗原抗体反応中に、異なる種からの抗体の混合物が調製されます。抗原賦活化時間や抗体濃度などの条件が最適化され、検証され、S/N比が向上します。この技術は再現性があり、免疫療法の研究や臨床応用のための貴重なツールとして機能します。

概要

脳転移(BM)は最も一般的な中枢神経系(CNS)腫瘍であり、非小細胞肺がん(NSCLC)症例のほぼ半数に発生し、予後不良である1。NSCLC患者の推定10%〜20%は、初期診断時にすでにBMを患っており、NSCLC症例の約40%は治療の過程でBMを発症します2。腫瘍微小環境(TME)は、血管、線維芽細胞、マクロファージ、細胞外マトリックス(ECM)、リンパ球、骨髄由来免疫細胞、シグナル伝達分子などのさまざまな構成要素を含む、NSCLCの発生およびBMと密接に関連しています3,4。微小環境免疫細胞は、がん細胞の増殖と発達に影響を与える上で重要な役割を果たします。脳転移は、複雑な免疫学的微小環境とシグナル伝達プロセスを特徴とする多数の潜在的な治療標的を提示します。例えば、PD-1阻害剤は、肺がん脳転移(LCBM)患者に対して、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)として臨床効果を示しています。しかしながら、PD-1療法に対する反応の頻度は、原発性NSCLCとLCBM5の間で異なり、腫瘍免疫微小環境が重要なICI調節因子として作用することが示唆されている。

免疫組織化学(IHC)は、生物学、基礎医学、病

プロトコル

この研究は、雲南がん病院/昆明医科大学第三附属病院の医療倫理委員会によって承認されました。すべての被験者/法定後見人はインフォームドコンセントに署名しました。

1. スライドの準備

  1. 原発性肺腫瘍または肺がんの脳転移細胞を含む対パラフィンブロックの切片を、ミクロトームを用いて厚さ4μmで切断します。切片を水にかけ、ピンセットで分離し、最適なものを選択して、ポリリジンでコーティングされたスライドに接着します。
  2. 組織のスライドを65°Cのオーブンに30分間入れて、組織の接着を強化します。
  3. スライドをキシレンに浸し、それぞれ10分間持続させる3回の変更を行います。
  4. アルコール濃度を徐々に下げ、100%エタノールで5分間、90%エタノールで5分間、75%エタノールで5分間、脱イオン水で3分間スライドをインキュベートします。

2. 熱誘起エピトープ賦活化(HIER)

  1. 100倍のクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)を脱イオン水で1倍(10 mM)に希釈し、スライドを完全に浸すのに十分な緩衝液を調製します。
  2. スライドを圧力鍋に入れ、強火(100°C)と高圧(~30psi)に2分間さらします。加熱後、スライドを蒸留水で室温まで3分間冷まし....

代表的な結果

5色マルチプレックス蛍光を用いたサイクリック抗原検出のプロトコルを1枚のスライドで紹介します。アッセイを最適化することで、異なる動物種由来の2つの抗体のインキュベーションが可能になりました(図1)。実験手順に必要な機器には、圧力鍋と免疫染色ボックスが含まれます(図2A)。

アッセイ終了後、スライドをスキャ?.......

ディスカッション

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学染色のプロセスについて説明しました。一次抗体の選択は、蛍光免疫組織化学アッセイの重要な側面であり、特異性と再現性を向上させるためにモノクローナル抗体が推奨されます。一次抗体の使用濃度を最適化するために、免疫組織化学実験を通じて一連の希釈液を試験しました。ポジティブコントロール(標的抗原発現を評価するため)と?.......

開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる競合する金銭的利害関係や個人的な関係は知られていないと宣言しています。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(NO.81860413、81960455)、雲南省科学技術部基金(202001AY070001-080)、雲南省教育部科学研究財団(2019J1274)の支援を受けました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x sodium citrate Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% hydrogen peroxideMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond primary antibody diluentLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd. kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
ethanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS(powder)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
slide viwer 3D histech Ltd
xyleneSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10023418

参考文献

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L.

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