Immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex

Riepilogo

L'immunoistochimica ciclica multiplex consente la rilevazione in situ di più marcatori contemporaneamente utilizzando l'incubazione ripetuta antigene-anticorpo, la scansione delle immagini e l'allineamento e l'integrazione delle immagini. Qui, presentiamo il protocollo operativo per l'identificazione dei substrati delle cellule immunitarie con questa tecnologia in campioni di carcinoma polmonare e metastasi cerebrali accoppiate.

Abstract

Il microambiente tumorale coinvolge le interazioni tra cellule ospiti, cellule tumorali, cellule immunitarie, cellule stromali e vascolarizzazione. La caratterizzazione e l'organizzazione spaziale dei sottoinsiemi di cellule immunitarie e delle proteine bersaglio sono cruciali per scopi prognostici e terapeutici. Ciò ha portato allo sviluppo di metodi di colorazione immunoistochimica multiplexati. L'immunoistochimica a fluorescenza multiplex consente la rilevazione simultanea di più marcatori, facilitando una comprensione completa della funzione cellulare e delle interazioni intercellulari. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro per il test di immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex e la sua applicazione nell'analisi di quantificazione di sottogruppi di linfociti. La colorazione immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex segue passaggi e reagenti simili a quelli dell'immunoistochimica standard, che prevede il recupero dell'antigene, l'incubazione ciclica degli anticorpi e la colorazione su un vetrino di tessuto in formalina fissata con paraffina (FFPE). Durante la reazione antigene-anticorpo, viene preparata una miscela di anticorpi di specie diverse. Le condizioni, come il tempo di recupero dell'antigene e la concentrazione di anticorpi, sono ottimizzate e convalidate per aumentare il rapporto segnale/rumore. Questa tecnica è riproducibile e funge da strumento prezioso per la ricerca sull'immunoterapia e le applicazioni cliniche.

Introduzione

Le metastasi cerebrali (BM) rappresentano i tumori più comuni del sistema nervoso centrale (SNC), che si verificano in quasi la metà dei casi di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), con una prognosi sfavorevole¹. Si stima che il 10%-20% dei pazienti con NSCLC abbia già BM al momento della diagnosi iniziale e circa il 40% dei casi di NSCLC svilupperà BM durante il corso del trattamento². Il microambiente tumorale (TME) è strettamente associato all'insorgenza di NSCLC e al midollo osseo, compresi vari componenti, come vasi sanguigni, fibroblasti, macrofagi, matrice extracellulare (ECM), cellule immunitarie li....

Protocollo

La ricerca è stata approvata dal comitato etico medico dello Yunnan Cancer Hospital/il terzo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Kunming. Tutti i soggetti/tutori legali hanno firmato il consenso informato.

1. Preparazione dei vetrini

1. Tagliare sezioni di blocchi di paraffina appaiati contenenti cellule di metastasi cerebrali di tumore polmonare primario o cancro del polmone a uno spessore di 4 μm utilizzando un microtomo. Rimuovere le sezioni dall'acqua e separarle con una pinzetta, scegliere la migliore e farla aderire al vetrino rivestito in polilisina.
2. Mettere i vetrini di fazzoletti in f....

Discussione

Abbiamo descritto il processo per la colorazione immunoistochimica a fluorescenza ciclica multiplex. La selezione degli anticorpi primari è un aspetto cruciale del test di immunoistochimica a fluorescenza e gli anticorpi monoclonali sono raccomandati per una migliore specificità e ripetibilità. Per ottimizzare la concentrazione di lavoro dell'anticorpo primario, sono state testate una serie di diluizioni attraverso esperimenti di immunoistochimica. Sia i controlli positivi (per valutare l'espressione dell'antigene ber.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418