Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

Resumen

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Resumen

El microambiente tumoral implica interacciones entre las células huésped, las células tumorales, las células inmunitarias, las células estromales y la vasculatura. La caracterización y organización espacial de los subconjuntos de células inmunitarias y las proteínas diana son cruciales para fines pronósticos y terapéuticos. Esto ha llevado al desarrollo de métodos de tinción inmunohistoquímica multiplexada. La inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple permite la detección simultánea de múltiples marcadores, lo que facilita una comprensión integral de la función celular y las interacciones intercelulares. En este artículo, describimos un flujo de trabajo para el ensayo de inmunohistoquímica fluorescente cíclico múltiple y su aplicación en el análisis de cuantificación de subconjuntos de linfocitos. La tinción inmunohistoquímica fluorescente cíclica múltiple sigue pasos y reactivos similares a los de la inmunohistoquímica estándar, que incluye la recuperación de antígenos, la incubación cíclica de anticuerpos y la tinción en un portaobjetos de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Durante la reacción antígeno-anticuerpo, se prepara una mezcla de anticuerpos de diferentes especies. Las condiciones, como el tiempo de recuperación de antígenos y la concentración de anticuerpos, se optimizan y validan para aumentar la relación señal-ruido. Esta técnica es reproducible y sirve como una herramienta valiosa para la investigación de inmunoterapia y aplicaciones clínicas.

Introducción

Las metástasis cerebrales (MO) representan los tumores más comunes del sistema nervioso central (SNC), que se presentan en casi la mitad de los casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), con un pronóstico precario¹. Se estima que entre el 10% y el 20% de los pacientes con CPNM ya tienen MO en el momento del diagnóstico inicial, y aproximadamente el 40% de los casos de CPNM desarrollarán MO durante el curso^{del tratamiento.} El microambiente tumoral (TME) está estrechamente asociado con la aparición de CPCNP y la MO, incluyendo varios componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extrac....

Protocolo

La investigación fue aprobada por el comité de ética médica del Hospital Oncológico de Yunnan / Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming. Todos los sujetos/tutores legales firmaron el consentimiento informado.

1. Preparación de portaobjetos

1. Cortar secciones de bloques de parafina pareados que contengan células de metástasis cerebrales de tumor de pulmón primario o cáncer de pulmón con un grosor de 4 μm utilizando un micrótomo. Retira las secciones al agua y sepáralas con unas pinzas, elige la mejor y adhiérela al portaobjetos recubierto de polilisina.
2. Coloque los portaobjetos de pañue....

Discusión

Hemos descrito el proceso de tinción inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplex. La selección primaria de anticuerpos es un aspecto crucial del ensayo de inmunohistoquímica de fluorescencia, y se recomiendan los anticuerpos monoclonales para una mejor especificidad y repetibilidad. Para optimizar la concentración de trabajo del anticuerpo primario, se han probado una serie de diluciones mediante experimentos de inmunohistoquímica. Tanto los controles positivos (para evaluar la expresión del antígeno d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418