Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

Resumen

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Resumen

El microambiente tumoral implica interacciones entre las células huésped, las células tumorales, las células inmunitarias, las células estromales y la vasculatura. La caracterización y organización espacial de los subconjuntos de células inmunitarias y las proteínas diana son cruciales para fines pronósticos y terapéuticos. Esto ha llevado al desarrollo de métodos de tinción inmunohistoquímica multiplexada. La inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple permite la detección simultánea de múltiples marcadores, lo que facilita una comprensión integral de la función celular y las interacciones intercelulares. En este artículo, describimos un flujo de trabajo para el ensayo de inmunohistoquímica fluorescente cíclico múltiple y su aplicación en el análisis de cuantificación de subconjuntos de linfocitos. La tinción inmunohistoquímica fluorescente cíclica múltiple sigue pasos y reactivos similares a los de la inmunohistoquímica estándar, que incluye la recuperación de antígenos, la incubación cíclica de anticuerpos y la tinción en un portaobjetos de tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE). Durante la reacción antígeno-anticuerpo, se prepara una mezcla de anticuerpos de diferentes especies. Las condiciones, como el tiempo de recuperación de antígenos y la concentración de anticuerpos, se optimizan y validan para aumentar la relación señal-ruido. Esta técnica es reproducible y sirve como una herramienta valiosa para la investigación de inmunoterapia y aplicaciones clínicas.

Introducción

Las metástasis cerebrales (MO) representan los tumores más comunes del sistema nervioso central (SNC), que se presentan en casi la mitad de los casos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), con un pronóstico precario¹. Se estima que entre el 10% y el 20% de los pacientes con CPNM ya tienen MO en el momento del diagnóstico inicial, y aproximadamente el 40% de los casos de CPNM desarrollarán MO durante el curso^{del tratamiento.} El microambiente tumoral (TME) está estrechamente asociado con la aparición de CPCNP y la MO, incluyendo varios componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células inmunitarias linfoides, derivadas de la médula ósea y moléculas de señalización ^3,4. Las células inmunitarias microambientales desempeñan un papel crucial en la influencia del crecimiento y desarrollo de las células cancerosas. Las metástasis cerebrales presentan numerosas dianas terapéuticas potenciales caracterizadas por microambientes inmunológicos complejos y procesos de señalización. Por ejemplo, los inhibidores de PD-1 han demostrado eficacia clínica para pacientes con metástasis cerebral de cáncer de pulmón (LCBM) como inhibidor de puntos de control inmunitario (ICI). Sin embargo, la frecuencia de las respuestas a la terapia con PD-1 varía entre el CPCNP primario y el LCBM⁵, lo que sugiere que el microambiente inmunitario tumoral actúa como un regulador crítico de la ICI.

La inmunohistoquímica (IHQ) es una herramienta invaluable en los campos de la biología, la medicina básica y la patología⁶. Este método de detección visualiza la expresión de antígeno a través de la interacción antígeno-anticuerpo en un portaobjetos de tejido⁷. La IHQ se utiliza para diagnosticar marcadores predictivos, evaluar marcadores pronósticos, guiar terapias dirigidas y explorar las funciones biológicas de las células tumorales⁸. Sin embargo, el método tradicional de IHQ solo puede detectar un biomarcador a la vez. Para hacer frente a esta limitación, la innovación de la tecnología inmunohistoquímica ha llevado al desarrollo de la inmunohistoquímica de fluorescencia múltiple (mfIHC), que permite la identificación simultánea de múltiples marcadores proteicos en el mismo portaobjetos tisular, tanto en campo claro como en campo fluorescente⁹. Este avance proporciona un análisis preciso de la composición celular y las interacciones moleculares entre las células estromales, las células inmunitarias y las células cancerosas dentro de la TME.

En este estudio, presentamos un protocolo de inmunohistoquímica cíclica múltiple para analizar la distribución espacial de las células inmunes. Se eligen dos anticuerpos primarios de diferentes especies, como conejo y rata, para la incubación simultáneamente, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. La recuperación de antígenos se realiza después de cada ronda de reacción antígeno-anticuerpo. Se bloquea la autofluorescencia y se utiliza 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. El panel incluye la detección secuencial de células CD3, CD8, CD20 y CK, las células se clasifican según los marcadores: células tumorales (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)^10,11.

Protocolo

La investigación fue aprobada por el comité de ética médica del Hospital Oncológico de Yunnan / Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Kunming. Todos los sujetos/tutores legales firmaron el consentimiento informado.

1. Preparación de portaobjetos

1. Cortar secciones de bloques de parafina pareados que contengan células de metástasis cerebrales de tumor de pulmón primario o cáncer de pulmón con un grosor de 4 μm utilizando un micrótomo. Retira las secciones al agua y sepáralas con unas pinzas, elige la mejor y adhiérela al portaobjetos recubierto de polilisina.
2. Coloque los portaobjetos de pañuelos en un horno a 65 °C durante 30 minutos para mejorar la adherencia de los tejidos.
3. Sumerja los portaobjetos en xileno a través de tres cambios, cada uno de los cuales dura 10 minutos.
4. Reduzca gradualmente la concentración de alcohol e incube los portaobjetos en etanol al 100% durante 5 minutos, etanol al 90% durante 5 minutos, etanol al 75% durante 5 minutos y en agua desionizada durante 3 minutos.

2. Recuperación de epítopos inducida por calor (HIER)

1. Diluya 100x solución tampón de citrato de sodio (pH 6.0) a 1x (10 mM) en agua desionizada, preparando suficiente solución tampón para sumergir completamente los portaobjetos.
2. Coloque los portaobjetos en una olla a presión, sometiéndolos a calor alto (100 ° C) y presión (~ 30 psi) durante 2 min. Después de calentar, deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente en agua destilada durante 3 minutos.
3. Disolver un paquete de 52 g de solución salina tamponada con fosfato (PBS; en polvo) en 5 L de agua desionizada para preparar la solución tampón PBS (pH 7,0). Coloque los portaobjetos en una solución tampón PBS durante 5 minutos, con 3 cambios.

3. Bloqueo de la peroxidasa

1. Cubrir las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos en PBS, 3 veces durante 5 minutos cada uno.
2. Use papel de filtro para absorber el exceso de agua lejos del perímetro del tejido. Mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.

4. Incubación primaria de anticuerpos para la primera ronda

1. Preparar una mezcla de trabajo de los anticuerpos primarios para CD8 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon SP16) y CD20 (anticuerpo monoclonal de ratón, clon L26), diluida 1:50 en diluyente de anticuerpos primarios Bond.
2. Añadir el complejo de anticuerpos a las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Preparar una solución de solución salina tamponada con 0,1% de Tween/fosfato: 1 mL de Tween en 1 L de solución tampón de PBS.
4. Lave las secciones con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una. Use papel de filtro para alejar el exceso de agua del perímetro del pañuelo, mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.

5. Incubación secundaria de anticuerpos para la primera ronda

1. Preparar una mezcla de anticuerpo anti-conejo de cabra marcado con fluorescencia (Excitación (Ex): 495 nm) y anticuerpo anti-ratón de cabra (Ex: 578 nm), diluido 1:50 en solución salina tampón fosfato. El anticuerpo anti-conejo de cabra se une al anticuerpo primario de CD8, y el anticuerpo anti-ratón de cabra se une al anticuerpo primario de CD20.
2. Añadir la mezcla de anticuerpos secundarios gota a gota e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.

6. Recuperación de epítopos inducida por calor y bloqueo de peroxidasa

1. Diluir citrato de sodio 100x (pH 6.0) a 1x (10 mM) en agua desionizada, preparando suficiente solución tampón para sumergir completamente los portaobjetos.
2. Coloque los portaobjetos en una olla a presión y sométalos a alta temperatura (100 ° C) y presión (~ 30 psi) durante 1 min. Después de calentar, coloque los portaobjetos en agua destilada para que se enfríen a temperatura ambiente durante 3 minutos.
3. Realice el bloqueo de la peroxidasa como se describe en el paso 3.

7. Incubación primaria de anticuerpos para la segunda ronda

1. Preparar una mezcla de trabajo de los anticuerpos primarios para CD3 (anticuerpo monoclonal de conejo, clon SP7) y CK (anticuerpo monoclonal de ratón, MX005), diluida 1:50 en diluyente de anticuerpos primarios.
2. Añadir el complejo de anticuerpos a las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Lavar con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una. Use papel de filtro para alejar el exceso de agua del perímetro del pañuelo, mientras tanto, asegúrese de que el pañuelo esté húmedo.

8. Incubación secundaria de anticuerpos para la segunda ronda

1. Preparar una mezcla de anticuerpos anti-conejo de cabra (Ej: 652 nm) y anti-ratón de cabra (Ej: 590 nm), dilución 1:50 en solución salina tampón fosfato. El anticuerpo anti-conejo de cabra se une al anticuerpo primario de CD3, y el anticuerpo anti-ratón de cabra se une al anticuerpo primario de CK.
2. Agregue la mezcla de anticuerpos secundarios gota a gota, incube a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar con solución salina tamponada con 0,1 % de Tween/fosfato, 3 veces durante 5 minutos cada una.

9. Extinción por autofluorescencia y tinción DAPI

1. Añadir reactivo (0,15 M/L KMnO₄) a la sección de tejido durante 1 min. Enjuague con agua corriente durante 5 min.
   PRECAUCIÓN: KMnO₄ es tóxico y daña la piel. Asegúrese de usar guantes cuando manipule los portaobjetos. Si el líquido gotea sobre la piel, límpialo rápidamente con servilletas limpias y enjuaga con agua corriente.
2. Seque el portaobjetos con concentraciones crecientes de alcohol (70%, 90%, 100%), durante 3 min en cada concentración.
3. Agregue DAPI y cubreobjetos para obtener imágenes multiespectrales. La cantidad de DAPI depende del tamaño del tejido. Asegúrese de que el tejido esté completamente cubierto por DAPI después de agregar el cubreobjetos.

10. Escaneo de diapositivas

1. Coloque los portaobjetos en una bandeja y empuje hasta que no se pueda empujar más.
2. Para iniciar el programa, haga doble clic en el icono del programa en el escritorio. Durante el arranque, se muestra la ventana de selección de modo. La ventana de selección muestra dos modos de campo claro y fluorescente: modo automático y modo manual. En el modo de escaneo fluorescente, haga clic en Modo automático.
3. Mueva el cursor del ratón sobre ? para mostrar la información sobre la configuración. Haga clic en Configuración de filtro > Canal de filtro para elegir el número de canal > Pseudocolor. Defina el color y guárdelo.
4. Haga clic en Trabajo rutinario > Modo de escaneo > Completamente automático. Haga clic en Trabajo rutinario > nombre de diapositiva para definir el nombre de diapositiva para la salida. Haga clic en Trabajo rutinario > Configuración de canal para elegir filtros.
5. Haga clic en Trabajo rutinario > Opciones de escaneo para determinar la calidad resultante y la ubicación de almacenamiento de la diapositiva virtual.
6. Haga clic en Vista previa para establecer el umbral y seleccionar el rango que se va a escanear.
7. Haga clic en Hardware > Filtros > Live > Enfoque automático > Exposición automática > Ganancia digital > Marcar usar el tiempo de exposición manual > Marcar limitando el rango > Establecer actual.
8. Haga clic en Trabajo rutinario > Iniciar escaneo. Seleccione el nivel de aumento como 20x o 40x. Elija 20x para los tamaños de archivo adecuados. La extensión MRXS está definida por el escáner MIDI Pannoramic 3D. La extensión de imagen también se puede cambiar a imagen TIFF.
9. Haga clic en Visor de diapositivas > caja de herramientas Multivista para elegir la imagen para confocal y, a continuación, alinear e integrar la imagen.

11. Evaluación cuantitativa de densidades celulares

1. Cuantifique los porcentajes de células inmunitarias positivas (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) en áreas tumorales y de estroma con el software de escáner Halo 10. Validar la tinción de CK para definir el tejido tumoral.

Resultados

Presentamos un protocolo para la detección cíclica de antígenos mediante fluorescencia multiplex de 5 colores en un solo portaobjetos. A través de nuestra optimización del ensayo, permitimos la incubación de dos anticuerpos de diferentes especies (Figura 1). Los dispositivos necesarios para el procedimiento experimental incluyen una olla a presión y una caja de inmunotinción (Figura 2A).

Después de completar el ensayo, defini...

Discusión

Hemos descrito el proceso de tinción inmunohistoquímica de fluorescencia cíclica multiplex. La selección primaria de anticuerpos es un aspecto crucial del ensayo de inmunohistoquímica de fluorescencia, y se recomiendan los anticuerpos monoclonales para una mejor especificidad y repetibilidad. Para optimizar la concentración de trabajo del anticuerpo primario, se han probado una serie de diluciones mediante experimentos de inmunohistoquímica. Tanto los controles positivos (para evaluar la expresión del antígeno d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418