Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

요약

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

초록

종양 미세환경은 숙주 세포, 종양 세포, 면역 세포, 기질 세포 및 혈관 조직 간의 상호 작용을 포함합니다. 면역 세포 subset과 표적 단백질을 특성화하고 공간적으로 구성하는 것은 예후 및 치료 목적에 매우 중요합니다. 이는 다중 면역조직화학 염색법의 개발로 이어졌습니다. 다중 형광 면역조직화학을 통해 여러 마커를 동시에 검출할 수 있어 세포 기능 및 세포 간 상호 작용에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다. 이 논문에서는 다중 순환 형광 면역조직화학 분석을 위한 워크플로우와 림프구 하위 집합의 정량 분석에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 다중 순환 형광 면역조직화학 염색은 항원 회수, 순환 항체 배양 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 슬라이드 염색을 포함하는 표준 면역조직화학과 유사한 단계 및 시약을 따릅니다. 항원-항체 반응 중에 서로 다른 종의 항체 혼합물이 준비됩니다. 항원 회수 시간 및 항체 농도와 같은 조건은 신호 대 잡음비를 높이기 위해 최적화되고 검증됩니다. 이 기술은 재현성이 있으며 면역 요법 연구 및 임상 응용 분야에 유용한 도구 역할을 합니다.

서문

뇌 전이(BM)는 가장 흔한 중추신경계(CNS) 종양으로, 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 거의 절반에서 발생하며 예후가 좋지 않다¹. 비소세포폐암 환자의 약 10%-20%가 초기 진단 시점에 이미 BM을 가지고 있으며, 약 40%의 비소세포폐암 환자가 치료 과정에서 BM으로 발전한다². 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)은 혈관, 섬유아세포, 대식세포, 세포외기질(ECM), 림프구, 골수 유래 면역세포, 신호전달 분자 ^3,4와 같은 다양한 구성 요소를 포함하여 비소세포폐암(NSCLC) 발생 및 BM과 밀접한 관련이 있습니다. 미세환경 면역세포는 암세포의 성장과 발달에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. 뇌 전이는 복잡한 면역학적 미세환경과 신호전달 과정을 특징으로 하는 수많은 잠재적 치료 표적을 제시합니다. 예를 들어, PD-1 억제제는 면역관문억제제(ICI)로서 폐암 뇌전이(LCBM) 환자에게 임상적 효능을 보였다. 그러나 PD-1 요법에 대한 반응 빈도는 원발성 NSCLC와 LCBM⁵ 간에 다르며, 이는 종양 면역 미세환....

프로토콜

이 연구는 쿤밍 의과대학 윈난암병원/제3부속병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 피험자/법적 보호자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.

1. 슬라이드 준비

1. 원발성 폐종양 또는 폐암 뇌전이가 포함된 쌍의 파라핀 블록 절편을 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 세포를 절단합니다. 물을 묻힌 부분을 제거하고 핀셋으로 분리한 후 가장 좋은 부분을 선택하여 폴리리신 코팅 슬라이드에 부착합니다.
2. 조직 밀착력을 높이기 위해 65°C의 오븐에 조직 슬라이드를 30분 동안 넣습니다.
3. 슬라이드를 크실렌에 담그고 각각 10분 동안 지속되는 세 번의 변화를 거칩니다.
4. 점차적으로 알코올 농도를 낮추고 슬라이드를 100% 에탄올에서 5분, 90% 에탄올에서 5분, 75% 에탄올에서 5분, 탈이온수에서 3분 동안 배양합니다.

2. 열 유도 에피토프 회수(HIER)

1. 100x 구연산나트륨 완충 용액(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 완충 용액을 준비합니다.
2. 슬라이드를 압력솥에....

토론

우리는 다중 순환 형광 면역조직화학 염색 과정을 설명했습니다. 1차 항체 선택은 형광 면역조직화학 분석의 중요한 측면이며, 더 나은 특이성과 반복성을 위해 단클론 항체를 권장합니다. 1차 항체의 작동 농도를 최적화하기 위해 면역조직화학 실험을 통해 일련의 희석액을 테스트했습니다. 양성 대조군(표적 항원 발현 평가)과 음성 대조군(1차 항체 배양 없음)은 모두 필수적이며 설정해야 합니?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418