Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

요약

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

초록

종양 미세환경은 숙주 세포, 종양 세포, 면역 세포, 기질 세포 및 혈관 조직 간의 상호 작용을 포함합니다. 면역 세포 subset과 표적 단백질을 특성화하고 공간적으로 구성하는 것은 예후 및 치료 목적에 매우 중요합니다. 이는 다중 면역조직화학 염색법의 개발로 이어졌습니다. 다중 형광 면역조직화학을 통해 여러 마커를 동시에 검출할 수 있어 세포 기능 및 세포 간 상호 작용에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다. 이 논문에서는 다중 순환 형광 면역조직화학 분석을 위한 워크플로우와 림프구 하위 집합의 정량 분석에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 다중 순환 형광 면역조직화학 염색은 항원 회수, 순환 항체 배양 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 슬라이드 염색을 포함하는 표준 면역조직화학과 유사한 단계 및 시약을 따릅니다. 항원-항체 반응 중에 서로 다른 종의 항체 혼합물이 준비됩니다. 항원 회수 시간 및 항체 농도와 같은 조건은 신호 대 잡음비를 높이기 위해 최적화되고 검증됩니다. 이 기술은 재현성이 있으며 면역 요법 연구 및 임상 응용 분야에 유용한 도구 역할을 합니다.

서문

뇌 전이(BM)는 가장 흔한 중추신경계(CNS) 종양으로, 비소세포폐암(NSCLC) 사례의 거의 절반에서 발생하며 예후가 좋지 않다¹. 비소세포폐암 환자의 약 10%-20%가 초기 진단 시점에 이미 BM을 가지고 있으며, 약 40%의 비소세포폐암 환자가 치료 과정에서 BM으로 발전한다². 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)은 혈관, 섬유아세포, 대식세포, 세포외기질(ECM), 림프구, 골수 유래 면역세포, 신호전달 분자 ^3,4와 같은 다양한 구성 요소를 포함하여 비소세포폐암(NSCLC) 발생 및 BM과 밀접한 관련이 있습니다. 미세환경 면역세포는 암세포의 성장과 발달에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. 뇌 전이는 복잡한 면역학적 미세환경과 신호전달 과정을 특징으로 하는 수많은 잠재적 치료 표적을 제시합니다. 예를 들어, PD-1 억제제는 면역관문억제제(ICI)로서 폐암 뇌전이(LCBM) 환자에게 임상적 효능을 보였다. 그러나 PD-1 요법에 대한 반응 빈도는 원발성 NSCLC와 LCBM⁵ 간에 다르며, 이는 종양 면역 미세환경이 중요한 ICI 조절자로 작용한다는 것을 시사한다.

면역조직화학(IHC)은 생물학, 기초 의학 및 병리학 분야에서 매우 유용한 도구입니다⁶. 이 검출 방법은 조직 슬라이드(⁷) 상의 항원-항체의 상호작용을 통해 항원 발현을 시각화한다. IHC는 예측 마커를 진단하고, 예후 마커를 평가하고, 표적 치료를 안내하고, 종양 세포의 생물학적 기능을 탐색하는 데 사용됩니다⁸. 그러나 기존의 IHC 방법은 한 번에 하나의 바이오마커만 검출할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 면역조직화학 기술의 혁신은 다중 형광 면역조직화학(mfIHC)의 개발로 이어졌으며, 이를 통해 명시야 및 형광 필드 모두에서 동일한 조직 슬라이드에서 여러 단백질 마커를 동시에 식별할 수 있습니다⁹. 이러한 발전은 TME 내에서 기질 세포, 면역 세포 및 암세포 간의 세포 구성 및 분자 상호 작용에 대한 정확한 분석을 제공합니다.

본 연구에서는 면역세포의 공간적 분포를 분석하기 위한 multiplex cyclic immunohistochemistry 프로토콜을 제시합니다. 토끼와 쥐와 같은 서로 다른 종의 두 가지 1차 항체를 동시에 선택하여 배양한 후 형광 표지 2차 항체를 선택합니다. 항원 회수는 항원-항체 반응의 각 라운드 후에 수행됩니다. 자가형광은 차단되고 4', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)은 핵 염색에 사용됩니다. 이 패널에는 CD3, CD8, CD20 및 CK의 순차 검출이 포함되어 있으며, 세포는 마커에 따라 종양 세포(CK+), 성숙 T 세포(CD3+), 세포 독성 T 세포(CD3+CD8+), B 세포(CD20+)로 분류됩니다^10,11.

프로토콜

이 연구는 쿤밍 의과대학 윈난암병원/제3부속병원 의료윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 피험자/법적 보호자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.

1. 슬라이드 준비

1. 원발성 폐종양 또는 폐암 뇌전이가 포함된 쌍의 파라핀 블록 절편을 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께로 세포를 절단합니다. 물을 묻힌 부분을 제거하고 핀셋으로 분리한 후 가장 좋은 부분을 선택하여 폴리리신 코팅 슬라이드에 부착합니다.
2. 조직 밀착력을 높이기 위해 65°C의 오븐에 조직 슬라이드를 30분 동안 넣습니다.
3. 슬라이드를 크실렌에 담그고 각각 10분 동안 지속되는 세 번의 변화를 거칩니다.
4. 점차적으로 알코올 농도를 낮추고 슬라이드를 100% 에탄올에서 5분, 90% 에탄올에서 5분, 75% 에탄올에서 5분, 탈이온수에서 3분 동안 배양합니다.

2. 열 유도 에피토프 회수(HIER)

1. 100x 구연산나트륨 완충 용액(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 완충 용액을 준비합니다.
2. 슬라이드를 압력솥에 넣고 100분 동안 고열(30°C)과 압력(~2psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에서 3분 동안 실온으로 식힙니다.
3. PBS 완충 용액(pH 7.0)을 제조하기 위해 5L의 탈이온수에 인산염 완충 식염수(PBS, 분말) 52g 한 패킷을 녹입니다. 슬라이드를 PBS 버퍼 용액에 5분 동안 넣고 3번 변경합니다.

3. 과산화효소 차단

1. 절편을 3% 과산화수소로 덮고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 각각 3분 동안 5번 헹굽니다.
2. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 흡수합니다. 한편, 티슈가 촉촉한지 확인하십시오.

4. 1차 항체 배양

1. CD8 (토끼 단클론 항체, 클론 SP16) 및 CD20 (마우스 단클론 항체, 클론 L26)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 Bond 1 차 항체 희석제에서 1:50으로 희석하여 준비합니다.
2. 항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
3. PBS 완충 용액 1L에 Tween 1mL를 함유한 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수 용액을 준비합니다.
4. 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 절편을 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.

5. 1차 항체 배양

1. 형광 표지된 염소 항-토끼 항체(Excitation (Ex): 495 nm) 및 염소 항-마우스 항체(Ex: 578 nm)의 혼합물을 인산염 완충 식염수에 1:50으로 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD8의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CD20의 1차 항체에 부착됩니다.
2. 2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

6. 열 유도 에피토프 회수 및 과산화효소 차단

1. 100x 구연산나트륨(pH 6.0)을 탈이온수에 1x(10mM)로 희석하여 슬라이드가 완전히 잠길 수 있는 충분한 완충 용액을 준비합니다.
2. 슬라이드를 압력솥에 넣고 1분 동안 고열(100°C)과 압력(~30psi)에 노출시킵니다. 가열 후 슬라이드를 증류수에 넣어 실온으로 3분 동안 식힙니다.
3. 3단계에서 설명한 대로 과산화효소 차단을 수행합니다.

7. 2차 항체 배양

1. CD3 (토끼 단클론 항체, 클론 SP7) 및 CK (마우스 단클론 항체, MX005)에 대한 1 차 항체의 작동 혼합물을 1 차 항체 희석액에 1:50으로 희석하여 준비합니다.
2. 항체 복합체를 절편에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다. 여과지를 사용하여 조직 주변에서 과도한 물을 빼내고 조직이 촉촉한지 확인하십시오.

8. 2차 항체 배양

1. 염소 항-토끼(Ex: 652 nm)와 염소 항-마우스 항체(Ex: 590 nm)를 혼합하여 인산염 완충 식염수로 1:50 희석하여 제조한다. 염소 항 토끼 항체는 CD3의 1차 항체에 부착되고, 염소 항 마우스 항체는 CK의 1차 항체에 부착됩니다.
2. 2차 항체 혼합물을 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 0.1% 트윈/인산염 완충 식염수로 각각 5분씩 3번 세척합니다.

9. 자가형광 담금질 및 DAPI 염색

1. 시약(0.15 M/L KMnO₄)을 조직 섹션에 1분 동안 추가합니다. 흐르는 물로 5분 동안 헹굽니다.
   주의 : KMnO₄ 는 독성이 있으며 피부를 손상시킵니다. 슬라이드를 다룰 때는 반드시 장갑을 착용하십시오. 액체가 피부에 떨어지면 깨끗한 냅킨으로 빠르게 닦아내고 흐르는 물로 씻어내십시오.
2. 알코올 농도를 높인 상태(70%, 90%, 100%)로 슬라이드를 각 농도에서 3분 동안 건조시킵니다.
3. 다중 스펙트럼 이미징을 위해 DAPI 및 커버슬립을 추가합니다. DAPI의 양은 조직 크기에 따라 다릅니다. 커버슬립을 추가한 후 조직이 DAPI로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.

10. 슬라이드 스캔

1. 슬라이드를 트레이에 놓고 더 이상 밀 수 없을 때까지 밉니다.
2. 프로그램을 시작하려면 바탕 화면에서 프로그램 아이콘을 두 번 클릭합니다. 시작하는 동안 모드 선택 창이 표시됩니다. 선택 창에는 두 가지 명시야 및 형광 모드(자동 모드와 수동 모드)가 표시됩니다. 형광 스캔 모드에서 자동 모드(Automatic Mode)를 클릭합니다.
3. 마우스 커서를 ? 버튼을 눌러 설정에 대한 정보를 표시합니다. 필터 설정(Filter Setting) > 필터 채널(Filter Channel )을 클릭하여 채널 번호(Channel Number) > 의사 색상(Pseudo Color)을 선택합니다. 색상을 정의하고 저장합니다.
4. Routine Work(일상 작업) > Scanning Mode(스캔 모드)> 완전 자동(Full Automatic)을 클릭합니다. 루틴 작업(Routine Work) > 슬라이드 이름(Slide Name)을 클릭하여 출력할 슬라이드 이름을 정의합니다. [루틴 작업] > [채널 설정]을 클릭하여 필터를 선택합니다.
5. Routine Work > Scan Options(일상적인 작업) Scan Options(스캔 옵션)를 클릭하여 가상 슬라이드의 결과 품질과 저장 위치를 결정합니다.
6. 임계값 설정 및 스캔할 범위 선택을 위해 미리 보기(Preview )를 클릭합니다.
7. 하드웨어 > 필터(Hardware Filters) > 라이브 > 자동 초점(Auto Focus) > 자동 노출(Auto Exposure) > 디지털 게인(Digital Gain) > 틱(Tick)을 클릭하고 수동 노출 시간 사용(Use manual exposure time) > 틱(Tick)을 클릭하여 현재 설정(Set Current)> 범위를 제한합니다.
8. 일상적인 작업(Routine Work)> 스캔 시작(Start Scan)을 클릭합니다. 배율 수준을 20x 또는 40x로 선택합니다. 적절한 파일 크기로 20x를 선택합니다. MRXS 확장은 3D Pannoramic MIDI 스캐너에 의해 정의됩니다. 이미지 확장자를 TIFF 이미지로 변경할 수도 있습니다.
9. 슬라이드 뷰어 > Multiview Toolbox를 클릭하여 공초점에 사용할 이미지를 선택한 다음 이미지를 정렬하고 통합합니다.

11. 세포 밀도의 정량적 평가

1. Halo 10 스캐너 소프트웨어를 사용하여 종양 및 기질 영역에서 양성 면역 세포(CD3+, CD3+CD8+, CD20+)의 백분율을 정량화합니다. 종양 조직을 정의하기 위해 CK 염색을 검증합니다.

결과

단일 슬라이드에서 5색 다중 형광을 사용한 순환 항원 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 분석의 최적화를 통해 서로 다른 종의 두 항체를 배양할 수 있습니다(그림 1). 실험 절차에 필요한 장치에는 압력솥과 면역염색 상자가 포함됩니다(그림 2A).

분석을 완료한 후 슬라이드를 스캔하기 전에 4개의 마커의 유사 색상을 정의합니?...

토론

우리는 다중 순환 형광 면역조직화학 염색 과정을 설명했습니다. 1차 항체 선택은 형광 면역조직화학 분석의 중요한 측면이며, 더 나은 특이성과 반복성을 위해 단클론 항체를 권장합니다. 1차 항체의 작동 농도를 최적화하기 위해 면역조직화학 실험을 통해 일련의 희석액을 테스트했습니다. 양성 대조군(표적 항원 발현 평가)과 음성 대조군(1차 항체 배양 없음)은 모두 필수적이며 설정해야 합니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418