Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex

Résumé

L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.

Résumé

Le microenvironnement tumoral implique des interactions entre les cellules hôtes, les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules stromales et le système vasculaire. La caractérisation et l’organisation spatiale des sous-ensembles de cellules immunitaires et des protéines cibles sont cruciales à des fins pronostiques et thérapeutiques. Cela a conduit au développement de méthodes de coloration immunohistochimique multiplexées. L’immunohistochimie par fluorescence multiplex permet la détection simultanée de plusieurs marqueurs, facilitant une compréhension complète de la fonction cellulaire et des interactions intercellulaires. Dans cet article, nous décrivons un flux de travail pour le test d’immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex et son application dans l’analyse de quantification de sous-ensembles de lymphocytes. La coloration multiplex par immunohistochimie par fluorescence cyclique suit des étapes et des réactifs similaires à ceux de l’immunohistochimie standard, impliquant la récupération d’antigènes, l’incubation d’anticorps cycliques et la coloration sur une lame de tissu fixée au formol et enrobée de paraffine (FFPE). Au cours de la réaction antigène-anticorps, un mélange d’anticorps de différentes espèces est préparé. Les conditions, telles que le temps de récupération de l’antigène et la concentration d’anticorps, sont optimisées et validées pour augmenter le rapport signal/bruit. Cette technique est reproductible et constitue un outil précieux pour la recherche en immunothérapie et les applications cliniques.

Introduction

Les métastases cérébrales représentent les tumeurs du système nerveux central (SNC) les plus courantes, survenant dans près de la moitié des cas de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), avec un mauvais pronostic¹. On estime que 10 à 20 % des patients atteints de CPNPC sont déjà atteints de BM au moment du diagnostic initial, et qu’environ 40 % des cas de CPNPC développeront une BM au cours du traitement². Le microenvironnement tumoral (TME) est étroitement associé à l’apparition du CPNPC et de la BM, y compris divers composants, tels que les vaisseaux sanguins, les fibroblastes, les macrophages, la matrice ext....

Protocole

La recherche a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital du cancer du Yunnan / le troisième hôpital affilié de l’Université médicale de Kunming. Tous les sujets/tuteurs légaux ont signé un consentement éclairé.

1. Préparation des diapositives

1. Coupez des coupes de blocs de paraffine appariés contenant des cellules de métastases cérébrales de tumeur pulmonaire primitive ou de cancer du poumon d’une épaisseur de 4 μm à l’aide d’un microtome. Retirez les sections à l’eau et séparez-les avec une pince à épiler, choisissez la meilleure et collez-la sur la lame recouverte de polylysine.
2. Placez....

Discussion

Nous avons décrit le processus de coloration par immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplexe. La sélection des anticorps primaires est un aspect crucial du test d’immunohistochimie de fluorescence, et les anticorps monoclonaux sont recommandés pour une meilleure spécificité et répétabilité. Pour optimiser la concentration de travail de l’anticorps primaire, une série de dilutions a été testée par des expériences d’immunohistochimie. Les contrôles positifs (pour évaluer l’expression de l?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418