Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex

Résumé

L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.

Résumé

Le microenvironnement tumoral implique des interactions entre les cellules hôtes, les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules stromales et le système vasculaire. La caractérisation et l’organisation spatiale des sous-ensembles de cellules immunitaires et des protéines cibles sont cruciales à des fins pronostiques et thérapeutiques. Cela a conduit au développement de méthodes de coloration immunohistochimique multiplexées. L’immunohistochimie par fluorescence multiplex permet la détection simultanée de plusieurs marqueurs, facilitant une compréhension complète de la fonction cellulaire et des interactions intercellulaires. Dans cet article, nous décrivons un flux de travail pour le test d’immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex et son application dans l’analyse de quantification de sous-ensembles de lymphocytes. La coloration multiplex par immunohistochimie par fluorescence cyclique suit des étapes et des réactifs similaires à ceux de l’immunohistochimie standard, impliquant la récupération d’antigènes, l’incubation d’anticorps cycliques et la coloration sur une lame de tissu fixée au formol et enrobée de paraffine (FFPE). Au cours de la réaction antigène-anticorps, un mélange d’anticorps de différentes espèces est préparé. Les conditions, telles que le temps de récupération de l’antigène et la concentration d’anticorps, sont optimisées et validées pour augmenter le rapport signal/bruit. Cette technique est reproductible et constitue un outil précieux pour la recherche en immunothérapie et les applications cliniques.

Introduction

Les métastases cérébrales représentent les tumeurs du système nerveux central (SNC) les plus courantes, survenant dans près de la moitié des cas de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), avec un mauvais pronostic¹. On estime que 10 à 20 % des patients atteints de CPNPC sont déjà atteints de BM au moment du diagnostic initial, et qu’environ 40 % des cas de CPNPC développeront une BM au cours du traitement². Le microenvironnement tumoral (TME) est étroitement associé à l’apparition du CPNPC et de la BM, y compris divers composants, tels que les vaisseaux sanguins, les fibroblastes, les macrophages, la matrice extracellulaire (ECM), les lymphoïdes, les cellules immunitaires dérivées de la moelle osseuse et les molécules de signalisation ^3,4. Les cellules immunitaires microenvironnementales jouent un rôle crucial dans la croissance et le développement des cellules cancéreuses. Les métastases cérébrales présentent de nombreuses cibles thérapeutiques potentielles caractérisées par des microenvironnements immunologiques et des processus de signalisation complexes. Par exemple, les inhibiteurs de-1 ont montré une efficacité clinique pour les patients atteints de métastases cérébrales cancéreuses du poumon (LCBM) en tant qu’inhibiteur du point de contrôle immunitaire (ICI). Cependant, la fréquence des réponses au traitement par-1 varie entre le CPNPC primaire et le LCBM⁵, ce qui suggère que le microenvironnement immunitaire tumoral agit comme un régulateur essentiel des ICI.

L’immunohistochimie (IHC) est un outil inestimable dans les domaines de la biologie, de la médecine fondamentale et de la pathologie⁶. Cette méthode de détection visualise l’expression de l’antigène par l’interaction antigène-anticorps sur une lame de tissu⁷. L’IHC est utilisée pour diagnostiquer les marqueurs prédictifs, évaluer les marqueurs pronostiques, guider les thérapies ciblées et explorer les fonctions biologiques des cellules tumorales⁸. Cependant, la méthode IHC traditionnelle ne peut détecter qu’un seul biomarqueur à la fois. Pour remédier à cette limitation, l’innovation de la technologie immunohistochimique a conduit au développement de l’immunohistochimie par fluorescence multiplex (mfIHC), qui permet l’identification simultanée de plusieurs marqueurs protéiques sur la même lame de tissu, à la fois en fond clair et en champ fluorescent⁹. Cette avancée fournit une analyse précise de la composition cellulaire et des interactions moléculaires entre les cellules stromales, les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses au sein du TME.

Dans cette étude, nous présentons un protocole d’immunohistochimie cyclique multiplex pour analyser la distribution spatiale des cellules immunitaires. Deux anticorps primaires d’espèces différentes, comme le lapin et le rat, sont choisis pour l’incubation simultanée, suivis d’anticorps secondaires marqués par fluorescence. La récupération de l’antigène est effectuée après chaque série de réactions antigène-anticorps. L’autofluorescence est bloquée et le 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est utilisé pour colorer les noyaux. Le panel comprend la détection séquentielle des CD3, CD8, CD20 et CK, les cellules sont classées en fonction des marqueurs : cellules tumorales (CK+), cellules T matures (CD3+), cellules T cytotoxiques (CD3+CD8+), cellules B (CD20+)^10,11.

Protocole

La recherche a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital du cancer du Yunnan / le troisième hôpital affilié de l’Université médicale de Kunming. Tous les sujets/tuteurs légaux ont signé un consentement éclairé.

1. Préparation des diapositives

1. Coupez des coupes de blocs de paraffine appariés contenant des cellules de métastases cérébrales de tumeur pulmonaire primitive ou de cancer du poumon d’une épaisseur de 4 μm à l’aide d’un microtome. Retirez les sections à l’eau et séparez-les avec une pince à épiler, choisissez la meilleure et collez-la sur la lame recouverte de polylysine.
2. Placez les lames de tissus dans un four à 65 °C pendant 30 min pour améliorer l’adhérence des tissus.
3. Immergez les lames dans le xylène en trois changements d’une durée de 10 minutes chacun.
4. Réduire graduellement la concentration d’alcool et incuber les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 min, de l’éthanol à 90 % pendant 5 min, de l’éthanol à 75 % pendant 5 min et dans de l’eau déminéralisée pendant 3 min.

2. Récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER)

1. Diluer 100x solution tampon de citrate de sodium (pH 6,0) à 1x (10 mM) dans de l’eau désionisée, en préparant suffisamment de solution tampon pour immerger complètement les lames.
2. Placez les lames dans une cocotte-minute en les soumettant à une chaleur élevée (100 °C) et à une pression (~30 psi) pendant 2 min. Après chauffage, laissez les lames refroidir à température ambiante dans de l’eau distillée pendant 3 min.
3. Dissoudre un sachet de 52 g de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; en poudre) dans 5 L d’eau désionisée pour préparer une solution tampon de PBS (pH 7,0). Placez les lames dans la solution tampon PBS pendant 5 minutes, avec 3 changements.

3. Blocage de la peroxydase

1. Couvrir les sections avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % et incuber pendant 10 min à température ambiante. Rincer les lames au PBS, 3x pendant 5 min chacune.
2. Utilisez du papier filtre pour absorber l’excès d’eau loin du périmètre du tissu. Pendant ce temps, assurez-vous que le tissu est humide.

4. Incubation primaire des anticorps pour le premier tour

1. Préparez un mélange fonctionnel des anticorps primaires pour CD8 (anticorps monoclonal de lapin, clone SP16) et CD20 (anticorps monoclonal de souris, clone L26), dilués 1:50 dans un diluant d’anticorps primaire de Bond.
2. Ajouter le complexe d’anticorps sur les sections et incuber pendant 1 h à température ambiante.
3. Préparer une solution saline tamponnée à 0,1 % de Tween/phosphate : 1 mL de Tween dans 1 L de solution tampon PBS.
4. Lavez les sections avec 0,1 % de solution saline tamponnée au phosphate, 3 fois pendant 5 minutes chacune. Utilisez du papier filtre pour éloigner l’excès d’eau du périmètre du tissu, pendant ce temps, assurez-vous que le tissu est humide.

5. Incubation secondaire des anticorps pour le premier tour

1. Préparez un mélange d’anticorps anti-lapin de chèvre marqué par fluorescence (Excitation (Ex) : 495 nm) et d’anticorps anti-souris de chèvre (Ex : 578 nm), dilué 1:50 dans une solution saline tampon phosphate. L’anticorps anti-lapin de chèvre se fixe à l’anticorps primaire de CD8, et l’anticorps anti-souris de chèvre se fixe à l’anticorps primaire de CD20.
2. Ajouter le mélange d’anticorps secondaires goutte à goutte et incuber à température ambiante pendant 1 h.

6. Récupération d’épitopes induite par la chaleur et blocage de la peroxydase

1. Diluer 100x citrate de sodium (pH 6,0) à 1x (10 mM) dans de l’eau désionisée, en préparant suffisamment de solution tampon pour immerger complètement les lames.
2. Placez les lames dans un autocuiseur et soumettez-les à une chaleur élevée (100 °C) et à une pression (~30 psi) pendant 1 min. Après chauffage, placez les lames dans de l’eau distillée pour qu’elles refroidissent à température ambiante pendant 3 minutes.
3. Effectuez le blocage de la peroxydase comme décrit à l’étape 3.

7. Incubation primaire des anticorps pour le deuxième tour

1. Préparez un mélange fonctionnel des anticorps primaires pour CD3 (anticorps monoclonal de lapin, clone SP7) et CK (anticorps monoclonal de souris, MX005), dilués 1:50 dans un diluant d’anticorps primaire.
2. Ajouter le complexe d’anticorps sur les sections et incuber pendant 1 h à température ambiante.
3. Laver avec 0,1 % de solution saline tamponnée au phosphate, 3x pendant 5 min chacune. Utilisez du papier filtre pour éloigner l’excès d’eau du périmètre du tissu, pendant ce temps, assurez-vous que le tissu est humide.

8. Incubation secondaire des anticorps pour le deuxième tour

1. Préparer un mélange d’anticorps anti-lapin (Ex : 652 nm) et d’anticorps anti-souris (Ex : 590 nm), dilution 1:50 dans une solution saline tampon phosphate. L’anticorps anti-lapin de chèvre se fixe à l’anticorps primaire de CD3, et l’anticorps anti-souris de chèvre se fixe à l’anticorps primaire de CK.
2. Ajouter le mélange d’anticorps secondaires goutte à goutte, incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver avec 0,1 % de solution saline tamponnée au phosphate, 3x pendant 5 min chacune.

9. Trempe par autofluorescence et coloration DAPI

1. Ajouter le réactif (0,15 M/L KMnO₄) à la coupe de tissu pendant 1 min. Rincer à l’eau courante pendant 5 min.
   ATTENTION : KMnO₄ est toxique et endommage la peau. Assurez-vous de porter des gants lorsque vous manipulez les diapositives. Si le liquide coule sur la peau, essuyez-le rapidement avec des serviettes propres et rincez à l’eau courante.
2. Séchez la lame avec des concentrations croissantes d’alcool (70 %, 90 %, 100 %), pendant 3 minutes à chaque concentration.
3. Ajoutez DAPI et lamelle pour l’imagerie multispectrale. La quantité de DAPI dépend de la taille du tissu. Assurez-vous que le tissu est complètement recouvert de DAPI après l’ajout de la lamelle.

10. Numérisation des lames

1. Placez les lames sur un plateau et poussez jusqu’à ce qu’elles ne puissent plus être poussées.
2. Pour démarrer le programme, double-cliquez sur l’icône du programme sur le bureau. Au démarrage, la fenêtre de sélection du mode s’affiche. La fenêtre de sélection affiche deux modes fond clair et fluorescent : mode automatique et mode manuel. En mode de balayage fluorescent, cliquez sur Mode automatique.
3. Déplacez le curseur de la souris sur ? pour afficher les informations sur les paramètres. Cliquez sur Paramètre de filtre > Filtrer le canal pour choisir le numéro de canal > la pseudo-couleur. Définissez la couleur et enregistrez.
4. Cliquez sur Travail de routine > mode de numérisation > Entièrement automatique. Cliquez sur Travail de routine > nom de la diapositive pour définir le nom de la diapositive pour la sortie. Cliquez sur Travail de routine > Paramètres de canal pour choisir des filtres.
5. Cliquez sur Options de travail > de numérisation de routine pour déterminer la qualité et l’emplacement de stockage de la diapositive virtuelle.
6. Cliquez sur Aperçu pour définir le seuil et sélectionner la plage à analyser.
7. Cliquez sur Matériel > Filtres > Live > Mise au point automatique > Exposition automatique > Gain numérique > Cochez la case Utiliser le temps d’exposition manuelle > Cochez la case limitant la plage > Régler le courant.
8. Cliquez sur Travail de routine > Démarrer l’analyse. Sélectionnez le niveau de grossissement 20x ou 40x. Choisissez 20x pour les tailles de fichiers appropriées. L’extension MRXS est définie par un scanner MIDI Pannoramic 3D. L’extension d’image peut également être modifiée en image TIFF.
9. Cliquez sur Visionneuse de diapositives > Boîte à outils multivue pour choisir l’image à confocaliser, puis alignez et intégrez l’image.

11. Évaluation quantitative des densités cellulaires

1. Quantifiez les pourcentages de cellules immunitaires positives (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) dans les zones tumorales et stromales avec le logiciel de scanner Halo 10. Valider la coloration CK pour définir le tissu tumoral.

Résultats

Nous présentons un protocole de détection d’antigènes cycliques utilisant la fluorescence multiplex à 5 couleurs sur une seule lame. Grâce à notre optimisation du test, nous permettons l’incubation de deux anticorps d’espèces différentes (Figure 1). Les dispositifs nécessaires à la procédure d’expérience comprennent un autocuiseur et une boîte d’immunocoloration (Figure 2A).

Après avoir terminé le test, nous d...

Discussion

Nous avons décrit le processus de coloration par immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplexe. La sélection des anticorps primaires est un aspect crucial du test d’immunohistochimie de fluorescence, et les anticorps monoclonaux sont recommandés pour une meilleure spécificité et répétabilité. Pour optimiser la concentration de travail de l’anticorps primaire, une série de dilutions a été testée par des expériences d’immunohistochimie. Les contrôles positifs (pour évaluer l’expression de l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418