Мультиплексная циклическая флуоресцентная иммуногистохимия

Резюме

Мультиплексная циклическая иммуногистохимия позволяет in situ обнаруживать несколько маркеров одновременно с помощью повторной инкубации антиген-антитело, сканирования изображений, выравнивания и интеграции изображений. Здесь мы представляем операционный протокол идентификации субстратов иммунных клеток с помощью этой технологии в образцах рака легких и парных метастазов в головном мозге.

Аннотация

Микроокружение опухоли включает в себя взаимодействие между клетками хозяина, опухолевыми клетками, иммунными клетками, стромальными клетками и сосудистой сетью. Характеристика и пространственная организация субпопуляций иммунных клеток и белков-мишеней имеют решающее значение для прогностических и терапевтических целей. Это привело к разработке мультиплексных иммуногистохимических методов окрашивания. Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров, способствуя всестороннему пониманию функции клеток и межклеточных взаимодействий. В данной работе описывается рабочий процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического анализа и его применение в количественном анализе субпопуляций лимфоцитов. Мультиплексное циклическое флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание проходит те же этапы и реагенты, что и стандартная иммуногистохимия, включая извлечение антигена, циклическую инкубацию антител и окрашивание на предметном стекле ткани, закрепленном формалином и парафином (FFPE). Во время реакции антиген-антитело готовится смесь антител разных видов. Такие условия, как время извлечения антигена и концентрация антител, оптимизируются и проверяются для увеличения отношения сигнал/шум. Этот метод воспроизводим и служит ценным инструментом для исследований в области иммунотерапии и клинического применения.

Введение

Метастазы в головной мозг (БМ) представляют собой наиболее распространенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), встречающиеся почти в половине случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с неблагоприятным прогнозом¹. По оценкам, 10–20% пациентов с НМРЛ уже имеют БМ на момент постановки первоначального диагноза, и примерно у 40% пациентов с НМРЛ БМ развивается в течение курса лечения². Микроокружение опухоли (ТМЭ) тесно связано с возникновением НМРЛ и БМ, включая различные компоненты, такие как кровеносные сосуды, фибробласты, макрофаги, внеклеточный матрикс (ВКМ), лимфоидные иммунные клетки

протокол

Исследование было одобрено комитетом по медицинской этике Юньнаньской онкологической больницы/Третьей филиальной больницы Куньминского медицинского университета. Все субъекты/законные опекуны подписали информированное согласие.

1. Подготовка слайдов

1. С помощью микротома вырезать срезы парных парафиновых блоков, содержащих клетки первичной опухоли легкого или рака легкого с метастазами в головной мозг, толщиной 4 мкм. Срезы опустите в воду и отделите пинцетом, выберите лучший и приклейте его на предметное стекло с полилизиновым покрытием.
2. Поместите предметные стекла тканей в духовку при температуре 65 °C н....

Результаты

Представлен протокол циклической детекции антигена с использованием 5-цветной мультиплексной флуоресценции на одном предметном стекле. Благодаря оптимизации анализа мы обеспечиваем инкубацию двух антител разных видов (рис. 1). К необходимым приспособлениям для провед.......

Обсуждение

Описан процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания. Первичный выбор антител является решающим аспектом флуоресцентного иммуногистохимического анализа, и моноклональные антитела рекомендуются для лучшей специфичности и воспроизводимо.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418