Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Мультиплексная циклическая иммуногистохимия позволяет in situ обнаруживать несколько маркеров одновременно с помощью повторной инкубации антиген-антитело, сканирования изображений, выравнивания и интеграции изображений. Здесь мы представляем операционный протокол идентификации субстратов иммунных клеток с помощью этой технологии в образцах рака легких и парных метастазов в головном мозге.
Микроокружение опухоли включает в себя взаимодействие между клетками хозяина, опухолевыми клетками, иммунными клетками, стромальными клетками и сосудистой сетью. Характеристика и пространственная организация субпопуляций иммунных клеток и белков-мишеней имеют решающее значение для прогностических и терапевтических целей. Это привело к разработке мультиплексных иммуногистохимических методов окрашивания. Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров, способствуя всестороннему пониманию функции клеток и межклеточных взаимодействий. В данной работе описывается рабочий процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического анализа и его применение в количественном анализе субпопуляций лимфоцитов. Мультиплексное циклическое флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание проходит те же этапы и реагенты, что и стандартная иммуногистохимия, включая извлечение антигена, циклическую инкубацию антител и окрашивание на предметном стекле ткани, закрепленном формалином и парафином (FFPE). Во время реакции антиген-антитело готовится смесь антител разных видов. Такие условия, как время извлечения антигена и концентрация антител, оптимизируются и проверяются для увеличения отношения сигнал/шум. Этот метод воспроизводим и служит ценным инструментом для исследований в области иммунотерапии и клинического применения.
Метастазы в головной мозг (БМ) представляют собой наиболее распространенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), встречающиеся почти в половине случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с неблагоприятным прогнозом1. По оценкам, 10–20% пациентов с НМРЛ уже имеют БМ на момент постановки первоначального диагноза, и примерно у 40% пациентов с НМРЛ БМ развивается в течение курса лечения2. Микроокружение опухоли (ТМЭ) тесно связано с возникновением НМРЛ и БМ, включая различные компоненты, такие как кровеносные сосуды, фибробласты, макрофаги, внеклеточный матрикс (ВКМ), лимфоидные иммунные клетки, иммунные клетки костного мозга и сигнальные молекулы 3,4. Иммунные клетки микроокружения играют решающую роль во влиянии на рост и развитие раковых клеток. Метастазы в головном мозге представляют собой многочисленные потенциальные мишени для лечения, характеризующиеся сложным иммунологическим микроокружением и сигнальными процессами. Например, ингибиторы PD-1 показали клиническую эффективность у пациентов с метастазами рака легких в головной мозг (ЛКМ) в качестве ингибитора контрольных точек иммунного ответа (ИКТИ). Тем не менее, частота ответов на терапию PD-1 варьируется между первичным НМРЛ и LCBM5, что позволяет предположить, что опухолевое иммунное микроокружение действует как важнейший регулятор ICI.
Иммуногистохимия (ИГХ) является бесценным инструментом в области биологии, фундаментальной медицины и патологии6. Этот метод детекции визуализирует экспрессию антигена через взаимодействие антиген-антитело на предметном стеклеткани 7. ВПХ используется для диагностики прогностических маркеров, оценки прогностических маркеров, назначения таргетной терапии и изучения биологических функций опухолевых клеток8. Однако традиционный метод ВПХ может обнаружить только один биомаркер за раз. Чтобы устранить это ограничение, инновация иммуногистохимической технологии привела к разработке мультиплексной флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC), которая позволяет одновременно идентифицировать несколько белковых маркеров на одном и том же предметном стекле ткани, как в светлом, так и во флуоресцентном поле9. Это достижение обеспечивает точный анализ клеточного состава и молекулярных взаимодействий между стромальными клетками, иммунными клетками и раковыми клетками в пределах TME.
В данном исследовании представлен протокол мультиплексной циклической иммуногистохимии для анализа пространственного распределения иммунных клеток. Для инкубации одновременно выбираются два первичных антитела разных видов, таких как кролик и крыса, за которыми следуют флуоресцентно меченные вторичные антитела. Забор антигена проводится после каждого раунда реакции антиген-антитело. Аутофлуоресценция блокируется, и для окрашивания ядер используется 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Панель включает последовательное определение CD3, CD8, CD20 и КФК, клетки классифицируются по маркерам: опухолевые клетки (CK+), зрелые Т-клетки (CD3+), цитотоксические Т-клетки (CD3+CD8+), В-клетки (CD20+)10,11.
Исследование было одобрено комитетом по медицинской этике Юньнаньской онкологической больницы/Третьей филиальной больницы Куньминского медицинского университета. Все субъекты/законные опекуны подписали информированное согласие.
1. Подготовка слайдов
2. Извлечение эпитопов, индуцированных теплом (HIER)
3. Блокирование пероксидазы
4. Инкубация первичных антител для первого раунда
5. Инкубация вторичных антител для первого раунда
6. Теплоиндуцированный забор эпитопов и блокирование пероксидазы
7. Инкубация первичных антител для второго раунда
8. Инкубация вторичных антител для второго раунда
9. Аутофлюоресцентная тушка и окрашивание DAPI
10. Сканирование слайдов
11. Количественная оценка плотности клеток
Представлен протокол циклической детекции антигена с использованием 5-цветной мультиплексной флуоресценции на одном предметном стекле. Благодаря оптимизации анализа мы обеспечиваем инкубацию двух антител разных видов (рис. 1). К необходимым приспособлениям для провед...
Описан процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания. Первичный выбор антител является решающим аспектом флуоресцентного иммуногистохимического анализа, и моноклональные антитела рекомендуются для лучшей специфичности и воспроизводимо...
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NO.81860413, 81960455), Фондом Юньнаньского департамента науки и технологий (202001AY070001-080), Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Юньнань (2019J1274).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
DAPI | sig-ma | D8417 | |
ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
slide viwer | 3D histech Ltd | ||
xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены