Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мультиплексная циклическая иммуногистохимия позволяет in situ обнаруживать несколько маркеров одновременно с помощью повторной инкубации антиген-антитело, сканирования изображений, выравнивания и интеграции изображений. Здесь мы представляем операционный протокол идентификации субстратов иммунных клеток с помощью этой технологии в образцах рака легких и парных метастазов в головном мозге.

Аннотация

Микроокружение опухоли включает в себя взаимодействие между клетками хозяина, опухолевыми клетками, иммунными клетками, стромальными клетками и сосудистой сетью. Характеристика и пространственная организация субпопуляций иммунных клеток и белков-мишеней имеют решающее значение для прогностических и терапевтических целей. Это привело к разработке мультиплексных иммуногистохимических методов окрашивания. Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров, способствуя всестороннему пониманию функции клеток и межклеточных взаимодействий. В данной работе описывается рабочий процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического анализа и его применение в количественном анализе субпопуляций лимфоцитов. Мультиплексное циклическое флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание проходит те же этапы и реагенты, что и стандартная иммуногистохимия, включая извлечение антигена, циклическую инкубацию антител и окрашивание на предметном стекле ткани, закрепленном формалином и парафином (FFPE). Во время реакции антиген-антитело готовится смесь антител разных видов. Такие условия, как время извлечения антигена и концентрация антител, оптимизируются и проверяются для увеличения отношения сигнал/шум. Этот метод воспроизводим и служит ценным инструментом для исследований в области иммунотерапии и клинического применения.

Введение

Метастазы в головной мозг (БМ) представляют собой наиболее распространенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), встречающиеся почти в половине случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с неблагоприятным прогнозом1. По оценкам, 10–20% пациентов с НМРЛ уже имеют БМ на момент постановки первоначального диагноза, и примерно у 40% пациентов с НМРЛ БМ развивается в течение курса лечения2. Микроокружение опухоли (ТМЭ) тесно связано с возникновением НМРЛ и БМ, включая различные компоненты, такие как кровеносные сосуды, фибробласты, макрофаги, внеклеточный матрикс (ВКМ), лимфоидные иммунные клетки

протокол

Исследование было одобрено комитетом по медицинской этике Юньнаньской онкологической больницы/Третьей филиальной больницы Куньминского медицинского университета. Все субъекты/законные опекуны подписали информированное согласие.

1. Подготовка слайдов

  1. С помощью микротома вырезать срезы парных парафиновых блоков, содержащих клетки первичной опухоли легкого или рака легкого с метастазами в головной мозг, толщиной 4 мкм. Срезы опустите в воду и отделите пинцетом, выберите лучший и приклейте его на предметное стекло с полилизиновым покрытием.
  2. Поместите предметные стекла тканей в духовку при температуре 65 °C н....

Результаты

Представлен протокол циклической детекции антигена с использованием 5-цветной мультиплексной флуоресценции на одном предметном стекле. Благодаря оптимизации анализа мы обеспечиваем инкубацию двух антител разных видов (рис. 1). К необходимым приспособлениям для провед.......

Обсуждение

Описан процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания. Первичный выбор антител является решающим аспектом флуоресцентного иммуногистохимического анализа, и моноклональные антитела рекомендуются для лучшей специфичности и воспроизводимо.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NO.81860413, 81960455), Фондом Юньнаньского департамента науки и технологий (202001AY070001-080), Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Юньнань (2019J1274).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x sodium citrate Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% hydrogen peroxideMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond primary antibody diluentLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd. kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
ethanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS(powder)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
slide viwer 3D histech Ltd
xyleneSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10023418

Ссылки

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Cancer Research203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены