Zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Zusammenfassung

Die zyklische Multiplex-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen In-situ-Nachweis mehrerer Marker durch wiederholte Antigen-Antikörper-Inkubation, Bildscannen sowie Bildausrichtung und -integration. Hier stellen wir das Operationsprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubstraten mit dieser Technologie in Lungenkrebs- und gepaarten Hirnmetastasenproben vor.

Zusammenfassung

Die Tumormikroumgebung beinhaltet Wechselwirkungen zwischen Wirtszellen, Tumorzellen, Immunzellen, Stromazellen und Gefäßen. Die Charakterisierung und räumliche Organisation von Immunzelluntergruppen und Zielproteinen ist für prognostische und therapeutische Zwecke von entscheidender Bedeutung. Dies hat zur Entwicklung von Multiplex-Immunhistochemie-Färbemethoden geführt. Die Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Marker und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis der Zellfunktion und der interzellulären Interaktionen. In diesem Artikel beschreiben wir einen Arbeitsablauf für den zyklischen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assay und seine Anwendung in der Quantifizierungsanalyse von Lymphozyten-Untergruppen. Die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung folgt ähnlichen Schritten und Reagenzien wie die Standard-Immunhistochemie, einschließlich Antigengewinnung, zyklischer Antikörperinkubation und Färbung auf einem formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeobjektträger. Während der Antigen-Antikörper-Reaktion wird eine Mischung aus Antikörpern verschiedener Spezies hergestellt. Bedingungen, wie z. B. die Antigen-Retrieval-Zeit und die Antikörperkonzentration, werden optimiert und validiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Diese Technik ist reproduzierbar und dient als wertvolles Werkzeug für die Immuntherapieforschung und klinische Anwendungen.

Einleitung

Hirnmetastasen (BM) stellen die häufigsten Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS) dar, die bei fast der Hälfte der Fälle von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) auftreten und eine schlechte Prognose^{haben 1}. Schätzungsweise 10 % bis 20 % der NSCLC-Patienten haben zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits eine BM, und etwa 40 % der NSCLC-Fälle entwickeln im Verlauf der Behandlung eine BM². Die Tumormikroumgebung (TME) ist eng mit dem Auftreten und der BM von NSCLC verbunden, einschließlich verschiedener Komponenten wie Blutgefäße, Fibroblasten, Makrophagen, extrazelluläre Matrix (EZM), lymphoide, aus dem Knochenmark stammende Immunzellen und Signalmoleküle ^3,4. Mikroumgebungs-Immunzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung von Krebszellen. Hirnmetastasen stellen zahlreiche potenzielle Behandlungsziele dar, die durch komplexe immunologische Mikroumgebungen und Signalprozesse gekennzeichnet sind. Beispielsweise haben PD-1-Inhibitoren klinische Wirksamkeit bei Patienten mit Lungenkrebs-Hirnmetastasen (LCBM) als Immun-Checkpoint-Inhibitor (ICI) gezeigt. Die Häufigkeit des Ansprechens auf die PD-1-Therapie variiert jedoch zwischen primärem NSCLC und LCBM⁵, was darauf hindeutet, dass die Tumorimmunmikroumgebung als kritischer ICI-Regulator fungiert.

Die Immunhistochemie (IHC) ist ein unschätzbares Werkzeug in den Bereichen Biologie, Grundlagenmedizin und Pathologie⁶. Diese Nachweismethode visualisiert die Antigenexpression durch die Interaktion von Antigen-Antikörper auf einem Gewebeobjektträger⁷. IHC wird zur Diagnose prädiktiver Marker, zur Bewertung prognostischer Marker, zur Steuerung gezielter Therapien und zur Erforschung der biologischen Funktionen von Tumorzellen verwendet⁸. Die traditionelle IHC-Methode kann jedoch jeweils nur einen Biomarker nachweisen. Um diese Einschränkung zu beheben, hat die Innovation der immunhistochemischen Technologie zur Entwicklung der Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC) geführt, die die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Proteinmarker auf demselben Gewebeobjektträger ermöglicht, sowohl im Hellfeld als auch im Fluoreszenzfeld⁹. Dieser Fortschritt ermöglicht eine genaue Analyse der Zellzusammensetzung und der molekularen Wechselwirkungen zwischen Stromazellen, Immunzellen und Krebszellen innerhalb der TME.

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für zyklische Multiplex-Immunhistochemie vor, um die räumliche Verteilung von Immunzellen zu analysieren. Zwei Primärantikörper verschiedener Spezies, wie Kaninchen und Ratte, werden gleichzeitig für die Inkubation ausgewählt, gefolgt von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Die Antigen-Retrieval wird nach jeder Runde der Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt. Die Autofluoreszenz wird blockiert und 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wird zur Färbung der Zellkerne verwendet. Das Panel umfasst den sequentiellen Nachweis von CD3, CD8, CD20 und CK, die Zellen werden nach den Markern kategorisiert: Tumorzellen (CK+), reife T-Zellen (CD3+), zytotoxische T-Zellen (CD3+CD8+), B-Zellen (CD20+)^10,11.

Protokoll

Die Forschung wurde von der medizinischen Ethikkommission des Yunnan Cancer Hospital/des Third Affiliated Hospital der Kunming Medical University genehmigt. Alle Probanden/Erziehungsberechtigten haben eine Einverständniserklärung unterschrieben.

1. Vorbereitung der Objektträger

1. Schneiden Sie Abschnitte von gepaarten Paraffinblöcken, die primäre Lungentumor- oder Lungenkrebs-Hirnmetastasen enthalten, mit einer Dicke von 4 μm mit einem Mikrotom. Entfernen Sie die Abschnitte zum Wasser und trennen Sie sie mit einer Pinzette, wählen Sie die beste aus und kleben Sie sie auf den polylysinbeschichteten Objektträger.
2. Legen Sie die Gewebeobjektträger 30 Minuten lang bei 65 °C in einen Ofen, um die Gewebehaftung zu verbessern.
3. Tauchen Sie die Objektträger durch drei Wechsel, die jeweils 10 Minuten dauern, in Xylol.
4. Reduzieren Sie allmählich die Alkoholkonzentration und inkubieren Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 100 % Ethanol, 5 Minuten lang 90 % Ethanol, 5 Minuten lang 75 % Ethanol und 3 Minuten lang in entionisiertem Wasser.

2. Wärmeinduzierte Epitopgewinnung (HIER)

1. Verdünnen Sie 100x Natriumcitrat-Pufferlösung (pH 6,0) auf 1x (10 mM) in deionisiertem Wasser und bereiten Sie genügend Pufferlösung vor, um die Objektträger vollständig einzutauchen.
2. Legen Sie die Objektträger in einen Schnellkochtopf und setzen Sie sie 2 Minuten lang hoher Hitze (100 °C) und Druck (~30 psi) aus. Lassen Sie die Objektträger nach dem Erhitzen 3 Minuten lang in destilliertem Wasser auf Raumtemperatur abkühlen.
3. Eine Packung mit 52 g phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pulverisiert) in 5 l deionisiertem Wasser zur Herstellung einer PBS-Pufferlösung (pH 7,0) auflösen. Legen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit 3 Wechseln in die PBS-Pufferlösung.

3. Peroxidase-Blockierung

1. Die Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid bedecken und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie die Objektträger in PBS aus, 3x für jeweils 5 Minuten.
2. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes wegzunehmen. Achten Sie in der Zwischenzeit darauf, dass das Gewebe feucht ist.

4. Primärantikörper-Inkubation für die erste Runde

1. Bereiten Sie eine Arbeitsmischung der Primärantikörper für CD8 (monoklonaler Kaninchen-Antikörper, Klon SP16) und CD20 (monoklonaler Maus-Antikörper, Klon L26) her, verdünnt 1:50 in Bond-Primärantikörper-Verdünnungsmittel.
2. Den Antikörperkomplex auf die Schnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Bereiten Sie eine Lösung aus 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung vor: 1 ml Tween in 1 l PBS-Pufferlösung.
4. Waschen Sie die Abschnitte mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 3x für jeweils 5 min. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes abzuleiten, während Sie sicherstellen, dass das Gewebe feucht ist.

5. Inkubation von Sekundärantikörpern für die erste Runde

1. Bereiten Sie eine Mischung aus fluoreszenzmarkiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Anregung (Ex): 495 nm) und Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Ex: 578 nm) her, verdünnt 1:50 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung. Der Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bindet an den primären Antikörper von CD8 und der Ziegen-Anti-Maus-Antikörper an den primären Antikörper von CD20.
2. Die sekundäre Antikörpermischung tropfenweise zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.

6. Wärmeinduzierte Epitopgewinnung und Peroxidase-Blockierung

1. Verdünnen Sie 100x Natriumcitrat (pH 6,0) auf 1x (10 mM) in deionisiertem Wasser und bereiten Sie genügend Pufferlösung vor, um die Objektträger vollständig einzutauchen.
2. Legen Sie die Objektträger in einen Schnellkochtopf und setzen Sie sie 1 Minute lang hoher Hitze (100 °C) und Druck (~30 psi) aus. Legen Sie die Objektträger nach dem Erhitzen 3 Minuten lang in destilliertes Wasser, um sie auf Raumtemperatur abzukühlen.
3. Führen Sie die Peroxidase-Blockierung wie in Schritt 3 beschrieben durch.

7. Inkubation von Primärantikörpern für die zweite Runde

1. Bereiten Sie eine Arbeitsmischung der primären Antikörper für CD3 (monoklonaler Kaninchen-Antikörper, Klon SP7) und CK (monoklonaler Maus-Antikörper, MX005) vor, verdünnt 1:50 in primärem Antikörperverdünnungsmittel.
2. Den Antikörperkomplex auf die Schnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, 3x für jeweils 5 min. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges Wasser vom Umfang des Gewebes abzuleiten, während Sie sicherstellen, dass das Gewebe feucht ist.

8. Sekundäre Antikörperinkubation für die zweite Runde

1. Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (z. B. 652 nm) und Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (z. B. 590 nm) herstellen, Verdünnung 1:50 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung. Der Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bindet an den primären Antikörper von CD3 und der Ziegen-Anti-Maus-Antikörper an den primären Antikörper von CK.
2. Sekundäre Antikörpermischung tropfenweise zugeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit 0,1% Tween/phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, 3x für jeweils 5 min.

9. Autofluoreszenzlöschung und DAPI-Färbung

1. Reagenz (0,15 M/L KMnO₄) 1 Minute lang in den Gewebeschnitt geben. 5 Min. mit fließendem Wasser abspülen.
   ACHTUNG: KMnO₄ ist giftig und schädigt die Haut. Achten Sie darauf, beim Umgang mit den Objektträgern Handschuhe zu tragen. Wenn die Flüssigkeit auf die Haut tropft, wischen Sie sie schnell mit sauberen Servietten ab und spülen Sie sie mit fließendem Wasser ab.
2. Trocknen Sie den Objektträger mit steigenden Alkoholkonzentrationen (70 %, 90 %, 100 %) für 3 Minuten in jeder Konzentration.
3. Fügen Sie DAPI und Deckglas für multispektrale Bildgebung hinzu. Die Menge an DAPI hängt von der Gewebegröße ab. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe nach dem Hinzufügen des Deckglases vollständig von DAPI bedeckt ist.

10. Scannen von Objektträgern

1. Legen Sie die Objektträger auf ein Tablett und drücken Sie, bis es nicht mehr weiter geschoben werden kann.
2. Um das Programm zu starten, doppelklicken Sie auf das Programmsymbol auf dem Desktop. Während des Startvorgangs wird das Modusauswahlfenster angezeigt. Das Auswahlfenster zeigt zwei Hellfeld- und Fluoreszenzmodi an: den automatischen Modus und den manuellen Modus. Klicken Sie im Fluoreszenz-Scan-Modus auf Automatischer Modus.
3. Bewegen Sie den Mauszeiger über ? , um die Informationen zu den Einstellungen anzuzeigen. Klicken Sie auf Filtereinstellung > Filterkanal , um die Kanalnummer > Pseudofarbe auszuwählen. Definieren Sie die Farbe und speichern Sie.
4. Klicken Sie auf Routinearbeiten > Scanmodus > Vollautomatisch. Klicken Sie auf Routinearbeit > Folienname , um den Foliennamen für die Ausgabe zu definieren. Klicken Sie > Kanaleinstellungen auf Routinearbeit , um Filter auszuwählen.
5. Klicken Sie auf Routinearbeit > Scanoptionen , um die resultierende Qualität und den Speicherort des virtuellen Objektträgers zu bestimmen.
6. Klicken Sie auf Vorschau , um den Schwellenwert festzulegen und den zu scannenden Bereich auszuwählen.
7. Klicken Sie auf Hardware > Filter > Live > Autofokus > Automatische Belichtung > Digitale Verstärkung > Häkchen Manuelle Belichtungszeit verwenden > Häkchen, um den Bereich > Strom einstellen einzuschränken.
8. Klicken Sie auf Routinearbeiten > Scan starten. Wählen Sie die Vergrößerungsstufe als 20x oder 40x. Wählen Sie 20x für geeignete Dateigrößen. MRXS wird durch den 3D Pannoramic MIDI Scanner definiert. Die Bilderweiterung kann auch in ein TIFF-Bild geändert werden.
9. Klicken Sie auf Dia-Viewer > Multiview-Toolbox , um das Bild für die Konfiguration auszuwählen und dann auszurichten und zu integrieren.

11. Quantitative Bewertung von Zelldichten

1. Quantifizieren Sie den Prozentsatz positiver Immunzellen (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) in Tumor- und Stromabereichen mit der Halo 10 Scanner-Software. Validieren Sie die CK-Färbung zur Definition von Tumorgewebe.

Ergebnisse

Wir präsentieren ein Protokoll für den zyklischen Antigennachweis mit 5-Farben-Multiplex-Fluoreszenz auf einem einzigen Objektträger. Durch unsere Optimierung des Assays ermöglichen wir die Inkubation von zwei Antikörpern aus verschiedenen Spezies (Abbildung 1). Zu den notwendigen Geräten für den Versuchsablauf gehören ein Schnellkochtopf und eine Immunfärbebox (Abbildung 2A).

Nach Abschluss des Assays definieren wir die Pseu...

Diskussion

Wir haben den Prozess für die zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie-Färbung beschrieben. Die Auswahl der primären Antikörper ist ein entscheidender Aspekt des Fluoreszenz-Immunhistochemie-Assays, und monoklonale Antikörper werden für eine bessere Spezifität und Wiederholbarkeit empfohlen. Um die Arbeitskonzentration des primären Antikörpers zu optimieren, wurde eine Reihe von Verdünnungen durch immunhistochemische Experimente getestet. Sowohl Positivkontrollen (zur Beurteilung der Zielantigenexpressi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MST-8005
100x sodium citrate	Maixin Biotechnology Co., Ltd	MVS-0100
3% hydrogen peroxide	Maixin Biotechnology Co., Ltd	SP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI	3D histech Ltd	Pannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond primary antibody diluent	Lecia	AR9352
CD20	Maixin Biotechnology Co., Ltd	kit-0001
CD3	Maixin Biotechnology Co., Ltd.	kit-0003
CD8	Maixin Biotechnology Co., Ltd	RMA-0514
CK	Maixin Biotechnology Co. Ltd.	MAB-0671,
DAPI	sig-ma	D8417
ethanol	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS(powder)	Maixin Biotechnology Co., Ltd	PBS-0061
slide viwer	3D histech Ltd
xylene	Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD	10023418