طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة

Summary

وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Abstract

في الجسم الحي دراسات سلوك الورم هي عنصر أساسي في أبحاث السرطان. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران يمثل تحديات كبيرة في التكلفة والوقت. هنا ، نقدم يرقات الزرد كنموذج زرع له مزايا عديدة على نماذج الفئران ، بما في ذلك سهولة التعامل ، والتكلفة المنخفضة ، والمدة التجريبية القصيرة. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود نظام مناعي تكيفي خلال مراحل اليرقات يغني عن الحاجة إلى توليد واستخدام سلالات نقص المناعة. في حين توجد بروتوكولات راسخة لزراعة الأعضاء في أجنة الزرد ، فإننا نقدم هنا طريقة محسنة تتضمن تحديد مراحل الجنين من أجل النقل الأسرع وتحليل البقاء على قيد الحياة واستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم عبء المرض. يتم تنظيم الأجنة لتسهيل الحقن السريع للخلايا في صفار اليرقات وعلامات الخلايا لمراقبة اتساق بلعة الخلايا المحقونة. بعد الحقن ، يتم تقييم تحليل بقاء الجنين لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة). أخيرا ، يتم تقييم عبء المرض أيضا عن طريق وضع علامة على الخلايا المنقولة ببروتين فلوري وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تمكين قياس التدفق الخلوي من خلال طريقة موحدة لإعداد معلقات الخلايا من أجنة الزرد ، والتي يمكن استخدامها أيضا في إنشاء الثقافة الأولية لخلايا الزرد. باختصار ، يسمح الإجراء الموصوف هنا بإجراء تقييم أسرع لسلوك الخلايا السرطانية في الجسم الحي مع أعداد أكبر من لكل ذراع دراسة وبطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة.

Introduction

يعد تحليل سلوك الأورام استجابة للتغيير الجيني أو العلاج الدوائي في الجسم الحي عنصرا أساسيا في أبحاث السرطان^1،2،3،4. غالبا ما تتضمن هذه الدراسات استخدام نماذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة (Mus musculus)⁵ ؛ ومع ذلك ، فإن دراسات زراعة الأعضاء الخارجية في الفئران محدودة في كثير من النواحي ، بما في ذلك السعة المحدودة ، والمدة الممتدة ، والنفقات الكبيرة ، والحاجة إلى معدات تصوير متطورة لمراقبة تطور الأورام الداخلية ^6,7. على النقيض من ذلك ، يتي....

Protocol

وقد تمت صيانة أسماك الزرد وتغذيتها وتربيتها في ظروف الاستزراع المائي القياسية عند 28.5 درجة مئوية، كما هو موضح³¹. تم إجراء جميع التجارب المتعلقة بالزرد عند درجة الحرارة هذه. ومع ذلك ، بعد زراعة الأجانب ، تم استزراع عند 34 درجة مئوية طوال مدة التجربة ، وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).

1. تربية (3 أيام قبل الحقن)

1. توفير العلف الجاف (علف إضافي ؛ 5-6 حبيبات لكل سمكة) لأزواج الأسماك قبل أسبوع من التكاثر لزيادة صحة إلى أقصى حد وزيادة عدد الأجنة التي تنتجها أزواج التكاثر.
2. في المساء السابق لحصاد الأجنة ، قم بإعداد تربية في أحواض تربية مع فاصل يفصل بين....

النتائج

زرع الأعضاء
يوضح الشكل 1 عرضا شاملا للتجربة والتحليل بأكملهما ، بدءا من إنتاج الجنين إلى تقييم تطور المرض من خلال كل من تحليل البقاء على قيد الحياة وعبء المرض عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجلب هذا النهج العديد من التحسينات التي تعزز قابلية استنساخ وقابلية التوسع ?.......

Discussion

برزت زراعة الأجانب لسمك الزرد كبديل سريع وقوي وفعال من حيث التكلفة لدراسات الفئران¹². على الرغم من الإبلاغ عن عدة طرق لزراعة الزرد ، فقد أدى تكيفنا إلى تحسينات كبيرة. بالإضافة إلى توحيد المعلمات حول الإجراء ، تركز هذه التحسينات بشكل خاص على تسريع معدل إجراء حقن الورم ، وبالتال?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763