투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

요약

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

초록

종양 행동에 대한 생체 내 연구는 암 연구의 필수 요소입니다. 그러나 마우스의 사용은 비용과 시간면에서 상당한 문제를 야기합니다. 여기에서는 애벌레 제브라피시를 쥐 모델에 비해 취급 용이성, 저렴한 비용, 짧은 실험 기간 등 많은 장점이 있는 이식 모델로 제시합니다. 더욱이, 유충 단계에서 적응 면역 체계가 없기 때문에 면역 결핍 균주를 생성하고 사용할 필요가 없습니다. 제브라피시 배아에서 이종 이식을 위한 확립된 프로토콜이 존재하지만, 여기서는 더 빠른 전달을 위한 배아 병기 결정, 생존 분석 및 질병 부담을 평가하기 위한 유세포 분석의 사용과 관련된 개선된 방법을 제시합니다. 배아는 유충의 난황에 빠른 세포 주입을 용이하게 하고 주입된 세포 볼루스의 일관성을 모니터링하기 위해 세포 마킹을 촉진하기 위해 병기를 결정합니다. 주입 후, 배아 생존 분석은 주입 후 최대 7일(dpi)까지 평가됩니다. 마지막으로, 형광 단백질로 전달된 세포를 마킹하고 유세포 분석으로 분석하여 질병 부담을 평가합니다. 유세포 분석은 제브라피시 배아에서 세포 현탁액을 준비하는 표준화된 방법을 통해 가능하며, 이는 제브라피시 세포의 1차 배양을 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 절차를 사용하면 연구 군당 더 많은 수의 동물을 대상으로 생체 내 종양 세포의 거동을 보다 신속하게 평가할 수 있으며 보다 비용 효율적인 방식으로 수행할 수 있습니다.

서문

생체 내에서 유전자 변형 또는 약물 치료에 반응하는 종양의 거동 분석은 암 연구의 필수 요소입니다 1,2,3,4. 이러한 연구는 대부분 면역력이 저하된 마우스(Mus musculus) 모델⁵의 사용을 포함한다. 그러나 마우스에 대한 이종 이식 연구는 제한된 용량, 연장된 기간, 상당한 비용 및 내부 종양의 진행을 모니터링하기 위한 정교한 이미징 장비의 요구 사항을 포함하여 여러 측면에서 제한적입니다 ^6,7. 이와는 대조적으로, 제브라피시 모델(Danio rerio)은 더 큰 용량, 더 짧은 기간, 더 낮은 비용, 그리고 투명성으로 인해 질병 진행에 대한 간단한 모니터링을 가능하게 한다 ^8,9.

제브라피쉬는 자궁 외에서 ....

프로토콜

제브라피시의 유지, 먹이 및 사육은 기술된 바와 같이 28.5°C의 표준 양식 조건 하에서 이루어졌다³¹. 모든 제브라피시 관련 실험은 이 온도에서 수행되었습니다. 그러나, 이종 이식 후, 동물은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 절차에 따라 실험 기간 동안 34°C에서 배양했습니다.

1. 사육 (주입 3 일 전)

1. 번식 일주일 전에 물고기 쌍에게 건조 사료(추가 사료, 물고기 한 마리당 5-6개의 과립)를 제공하여 동물의 건강을 극대화하고 번식 쌍에 의해 생산되는 배아의 수를 늘리십시오.
2. 배아 채취 전날 저녁, 수컷과 암컷 물고기를 분리하는 칸막이가 있는 사육 탱크에 번식 동물을 설치하고 각 수컷당 2마리의 암컷의 하렘 짝짓기를 사용합니다.
   참고: 팔당 100마리의 동물로 구성된 4개 팔로 실험하는 경우 실험당 20쌍의 번식 쌍을 사용합니다. 필요한 번식 쌍의 수를 결정하기 위해 좋은 추정치는 캐스퍼 번식 쌍당 50개의 배아입니다. 또 다른 옵션은 보다 강력하고 색소가 있는 제브라피시 균주를 사용하고 색소 침착을 방지하기 위해 1-페닐 2-티오우레....

토론

제브라피시 이종 이식은 마우스 연구에 대한 빠르고 강력하며 비용 효율적인 대안으로 부상했습니다¹². 제브라피시 이종 이식에 대한 몇 가지 접근 방식이 보고되었지만, 우리의 적응은 상당한 개선을 가져왔습니다. 절차와 관련된 매개변수를 표준화하는 것 외에도 이러한 개선은 특히 종양 주입을 수행할 수 있는 속도를 가속화하는 데 중점을 두어 연구 그룹당 동물 수를 늘리?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763