Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Abstract

Gli studi in vivo sul comportamento dei tumori sono un punto fermo della ricerca sul cancro; Tuttavia, l'uso dei topi presenta sfide significative in termini di costi e tempo. Qui, presentiamo il pesce zebra larvale come un modello di trapianto che presenta numerosi vantaggi rispetto ai modelli murini, tra cui facilità di manipolazione, bassa spesa e breve durata sperimentale. Inoltre, l'assenza di un sistema immunitario adattativo durante gli stadi larvali ovvia alla necessità di generare e utilizzare ceppi immunodeficienti. Sebbene esistano protocolli consolidati per lo xenotrapianto in embrioni di zebrafish, presentiamo qui un metodo migliorato che coinvolge la stadiazione degli embrioni per un trasferimento più rapido, l'analisi della sopravvivenza e l'uso della citometria a flusso per valutare il carico della malattia. Gli embrioni vengono messi in scena per facilitare l'iniezione rapida di cellule nel tuorlo delle larve e la marcatura delle cellule per monitorare la consistenza del bolo cellulare iniettato. Dopo l'iniezione, l'analisi della sopravvivenza dell'embrione viene valutata fino a 7 giorni dopo l'iniezione (dpi). Infine, il carico di malattia viene valutato anche marcando le cellule trasferite con una proteina fluorescente e analizzando mediante citometria a flusso. La citometria a flusso è resa possibile da un metodo standardizzato di preparazione di sospensioni cellulari da embrioni di zebrafish, che potrebbe essere utilizzato anche per stabilire la coltura primaria di cellule di zebrafish. In sintesi, la procedura qui descritta consente una valutazione più rapida del comportamento delle cellule tumorali in vivo con un numero maggiore di animali per braccio di studio e in modo più economico.

Introduzione

L'analisi del comportamento dei tumori in risposta ad alterazioni genetiche o al trattamento farmacologico in vivo è un elemento essenziale della ricerca sul cancro 1,2,3,4. Tali studi comportano il più delle volte l'uso di modelli murini immunocompromessi (Mus musculus)⁵; Tuttavia, gli studi sugli xenotrapianti nei topi sono limitati sotto molti aspetti, tra cui capacità limitata, durata prolungata, spese significative e la necessità di sofisticate apparecchiature di imaging per monitorare la progressione dei tumori interni ^6,7. Al contrario, il modello del pesce zebra (Danio rerio) consente una maggiore capacità, una durata più breve, una spesa inferiore e, grazie alla loro trasparenza, un semplice monitoraggio della progressione della malattia ^8,9.

Il pesce zebra è un sistema modello di vertebrato ben sviluppato con sviluppo ex-utero e alta fecondità, con singole femmine che producono più di 100 embrioni¹⁰. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione dei processi di sviluppo utilizzando tecniche legate alla fluorescenza come i reporter. Infine, la conservazione dei processi critici di sviluppo li rende un modello ideale per molti tipi di studi, incluso il comportamento delle cellule maligne trapiantate^11,12. Gli embrioni di zebrafish wild-type sviluppano melanociti, che li rendono otticamente opachi entro le 2 settimane di età, ma questo è stato superato dalla generazione di embrioni di casper (roy^a9; mitfa^w2), che rimangono trasparenti per tutta la vita¹³. A causa delle loro proprietà ottiche, i pesci zebra casper sono riceventi ideali di cellule tumorali trapiantate 14,15,16. Lo xenotrapianto di cellule tumorali in zebrafish ha acquisito importanza negli ultimi 2 decenni 17,18,19,20,21. Gli embrioni di pesce zebra hanno un'immunità innata; Tuttavia, mancano di immunità adattativa durante il loro stadio larvale, rendendoli immunocompromessi dal punto di vista funzionale, il che consente loro di fungere da ospiti efficaci per gli xenotrapianti tumorali trapiantati²².

Sono stati sviluppati protocolli per l'attecchimento tumorale in embrioni di zebrafish e adulti che hanno considerato una serie di variabili diverse 23,24,25,26,27. Questi hanno esplorato numerosi siti di deposizione tumorale nel pesce zebra, comprese le iniezioni nel tuorlo, nello spazio peri-vitellino e nel cuore e in diversi stadi di sviluppo^16,28. Anche la temperatura ambiente dell'acquacoltura per gli xenotrapianti di pesce zebra è importante poiché l'allevamento del pesce zebra avviene in genere a 28 °C, mentre le cellule dei mammiferi crescono a 37 °C. Di conseguenza, deve essere impiegata una temperatura di compromesso che sia tollerata dai pesci ma che supporti la crescita del tumore, e 34 °C sembra raggiungere entrambi gli obiettivi²⁹. L'analisi del comportamento e della progressione dei tumori a seguito di xenotrapianto è un'altra importante area di interesse, e ciò comporta l'uso di una varietà di modalità di imaging e l'analisi della sopravvivenza³⁰. Uno dei principali vantaggi del modello zebrafish è la disponibilità di un gran numero di animali in studio per fornire un'immensa potenza statistica agli studi in vivo del comportamento tumorale; Tuttavia, gli approcci precedenti hanno fortemente limitato questo potenziale a causa della necessità di noiose procedure di montaggio per le iniezioni.

Qui, affrontiamo questa limitazione attraverso lo sviluppo di un metodo semplice e rapido con cui mettere in scena gli embrioni che consente un'elevata produttività e il monitoraggio della qualità dell'iniezione utilizzando la linea trasparente casper zebrafish. Ciò comporta l'iniezione di xenotrapianti nel sacco vitellino degli embrioni di pesce zebra casper a 2 giorni dalla fecondazione (dpf). Osserviamo la sopravvivenza degli embrioni dopo lo xenotrapianto come parte dell'analisi del comportamento tumorale. Mostriamo inoltre la valutazione del carico di malattia dopo xenotrapianto effettuando sospensioni di singole cellule e analizzando mediante citometria a flusso (Figura 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Il mantenimento, l'alimentazione e l'allevamento del pesce zebra sono avvenuti in condizioni di acquacoltura standard a 28,5 °C, come descritto³¹. Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra sono stati fatti a questa temperatura; tuttavia, dopo lo xenotrapianto, gli animali sono stati coltivati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento, in conformità con le procedure approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).

1. Allevamento (3 giorni prima dell'iniezione)

1. Fornire mangime secco (mangime extra; 5-6 granuli per pesce) alle coppie di pesci una settimana prima della riproduzione per massimizzare la salute degli animali e aumentare il numero di embrioni prodotti dalle coppie riproduttrici.
2. La sera prima del prelievo degli embrioni, sistemare gli animali riproduttori in vasche di riproduzione con un divisorio che separa i pesci maschi e femmine, utilizzando accoppiamenti harem di 2 femmine per ogni maschio.
   NOTA: Per esperimenti con 4 braccia di 100 animali per braccio, impiegare 20 coppie riproduttive per esperimento. Per determinare il numero di coppie riproduttive necessarie, una buona stima è di 50 embrioni per coppia riproduttiva casper . Un'altra opzione è quella di utilizzare un ceppo di pesce zebra più robusto e pigmentato e trattare con 1-fenil 2-tiourea (PTU) per prevenire la pigmentazione³¹. In pratica, l'esperimento dovrebbe essere ridimensionato in modo tale da avere abbastanza embrioni per iniettare il doppio del numero desiderato a 1 giorno dopo l'iniezione (dpi).

2. Raccolta degli embrioni (2 giorni prima dell'iniezione)

1. La mattina dopo, rimuovere i divisori, permettendo ai pesci di riprodursi.
2. Visualizzare gli embrioni nelle vasche 20 minuti (min) dopo aver rimosso i divisori.
3. Raccogli gli embrioni usando un setaccio in una capsula di Petri da 90 mm contenente acqua per embrioni fatta come descritto nel Libro del pesce zebra³¹.
   1. Per preparare l'acqua dell'embrione, aggiungere 1,5 ml di sali di riserva a 1 litro di acqua distillata e blu di metilene allo 0,1% finale. Preparare la soluzione salina brodo sciogliendo 40 g di sali marini (Tabella dei materiali) in 1 L di acqua distillata. La composizione ionica dell'acqua embrionale è K⁺ (0,68 mg/L), Cl⁻ (31,86 mg/L), Na⁺ (17,77 mg/L), SO₄⁻ (4,47 mg/L), Mg₂⁺ (2,14 mg/L) e Ca₂⁺ (0,68 mg/L).
4. Lasciate che il pesce zebra si riproduca per un'ora in più e raccogliete gli embrioni risultanti.
5. Raggruppa gli embrioni per l'esperimento.
6. La sera, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati o morti, che sono riconoscibili per la loro morfologia anormale, e fornire acqua fresca agli embrioni.

3. Mantenimento dell'embrione e preparazione degli strumenti per le iniezioni (1 giorno prima dell'iniezione)

1. La mattina seguente, rimuovi eventuali embrioni morti e fornisci acqua fresca agli embrioni.
2. Preparare una piastra di agarosio riscaldando l'1,5% di agarosio in acqua embrionale e versare la miscela riscaldata in una piastra Petri da 90 mm. Una piastra da 90 mm richiede 30-35 ml di miscela.
3. Estrarre gli aghi non filamentosi dai capillari di vetro (borosilicato) utilizzando l'estrattore dell'ago. Gli aghi vengono tirati (sotto pressione termica) producendo un'estremità chiusa; Agganciali con una pinza per generare un orifizio ottimale. Valutare l'idoneità dell'orifizio dell'ago determinando il volume di fluido spostato per unità di tempo (vedere sotto, paragrafo 6.3).
   NOTA: I capillari in vetro possono essere acquistati con o senza filamenti centrali. I capillari privi di filamenti centrali sono preferiti per le iniezioni cellulari.
4. Posizionare gli aghi in una piastra di Petri coperta da 90 mm nelle scanalature realizzate con l'argilla (argilla da modellare per bambini) fino all'uso (Figura 2A).

4. Preparazione ed etichettatura delle cellule leucemiche con CM-Dil (giorno dell'iniezione)

1. Mantenere le cellule da trapiantare in condizioni ottimali per la loro crescita. Le cellule di leucemia murina qui impiegate erano sufficienti (M82; Rpl22+/+) o carente (M109; Rpl22-/-) per la proteina ribosomiale Rpl22, che funziona come soppressore tumorale³².
2. Celle a pellet in provetta conica da 50 mL. Contare, quindi centrifugare a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Scartare il surnatante.
   NOTA: Il numero di celle necessarie sarà dettato dall'ambito e dalle condizioni sperimentali, ma 1 x 10⁶ celle è un buon punto di partenza.
3. Eseguire la colorazione CM-Dil
   NOTA: La colorazione CM-Dil consente il monitoraggio del bolo di iniezione.
   1. Preparare una soluzione madre di CM-Dil risospendendo un flaconcino da 50 μg di CM-Dil in 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO; 1 mg/mL o ~1 mM finale).
   2. Produrre una soluzione di lavoro diluendo il brodo (4,8 μL di colorante/mL) in siero fetale bovino all'1% (FBS)/soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente eventuali integratori di supporto necessari alle cellule da utilizzare.
4. Risospendere le cellule a 1 x 10⁶/100 μL nella soluzione di lavoro del colorante.
5. Incubare a 37 °C per 10 min.
   NOTA: Le condizioni di colorazione devono essere ottimizzate per le celle impiegate (tempo, ecc.). Le cellule utilizzate qui hanno richiesto due distinte incubazioni di 10 minuti a temperature diverse per ottenere una colorazione ottimale.
6. Lavare con 10 ml di 1x HBSS a temperatura ambiente (RT).
7. Cellule a pellet (centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a RT), decantare il surnatante, quindi risospendere con 10 mL di HBSS e ripetere lo stesso per un secondo lavaggio.
8. Risospendere le cellule tumorali colorate a 40.000 cellule/μL in FBS/PBS all'1% e in qualsiasi integratore di supporto necessario e mantenere la sospensione cellulare a 34 °C fino all'iniezione.
   NOTA: Sono stati necessari integratori di supporto per il mantenimento delle linee cellulari utilizzate in questo studio (ad esempio, FBS all'1% e citochine). Gli integratori e gli xenotrapianti potrebbero dover essere adattati alle particolari linee cellulari in studio. La PBS è stata selezionata qui al posto dei terreni per evitare qualsiasi potenziale tossicità nel tuorlo.

5. Dechorionation

1. Dechorionare manualmente gli embrioni di pesce zebra casper a 2 dpf utilizzando siringhe per iniezione di insulina con ingrandimento 2x in un microscopio ottico. Forare il corion con un ago mentre si usa l'altro ago per immobilizzare il corion.
   NOTA: L'uso della pronasi per la decorionazione non è raccomandato perché a volte provoca una riduzione della salute dell'embrione. La decelerazione degli embrioni a 2 dpf è preferibile perché è più facile e gli embrioni sono meno fragili rispetto ai tempi precedenti (1 dpf).
2. Durante la decorionazione, fare attenzione a non toccare gli embrioni con gli aghi. Toccare o danneggiare il tuorlo degli embrioni mediante il contatto involontario con gli aghi potrebbe causare la morte.
3. Rimuovere i corioni spogliati cambiando l'acqua dell'embrione.

6. Impostazione del microiniettore e dell'ago

1. Accendere il microiniettore e la pompa e creare le condizioni adatte per le microiniezioni di cellule. Una pressione di iniezione di 9-11 psi e un tempo di iniezione di 0,5 secondi (s) sono un buon punto di partenza per agganciare l'ago e impostare l'orifizio.
2. Caricare con cura la sospensione della linea cellulare tumorale (~5 μL) nel microago in un unico passaggio, evitando la formazione di bolle d'aria, che interromperanno il flusso cellulare all'interno dell'ago.
3. Tagliare l'estremità dell'ago con una pinza (numero di Dumont 5) per produrre un orifizio che supporterà l'espulsione di 10-15 nanolitri (nL) di sospensione cellulare per 0,2-0,3 s.
   NOTA: Il calcolo di cui sopra del volume nL viene eseguito utilizzando capillari di calibrazione, dove 1 mm = 30 nL. In breve, impostare il tempo a 0,5 s e, dopo ogni clip dell'ago, premere inietta e raccogliere il volume nel capillare di calibrazione. Quindi, la lunghezza del volume raccolto viene misurata utilizzando la scala al microscopio e il taglio dell'ago viene interrotto quando vengono iniettati 30 nL in 0,5 s. Quindi, impostare il tempo delle iniezioni su 0,2-0,3 s. (iniettando ~10-15 nL di cellule)

7. Preparazione dell'embrione per l'iniezione

1. Seleziona gli embrioni sani al microscopio, eliminando quelli con anomalie dello sviluppo come edema cardiaco o un tronco corto o curvo.
2. Anestetizzare gli embrioni utilizzando tricaina metansolfonato (MS-222; 0,16 g/L di acqua embrionale) per 1 minuto in una piastra di Petri da 90 mm.
3. Usa una pipetta di vetro Pasteur per raccogliere gli embrioni. Disporre 10-15 embrioni in posizione laterale sulla piastra di agarosio all'1,5% (Figura 2B-D).
4. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando la pipetta Pasteur, lasciando la quantità minima di acqua per embrioni necessaria per mantenere in vita gli embrioni.

8. Procedura di iniezione

1. Controllare al microscopio ottico per assicurarsi che le cellule si siano accumulate nella punta dell'ago.
2. Iniettare gli embrioni utilizzando l'ago calibrato per 0,2-0,3 s (con 10-15 nL corrispondenti a 400-600 cellule) nel tuorlo degli embrioni.
3. Ripetere l'iniezione per tutti gli embrioni, quindi raccoglierli in acqua fresca per embrioni.
   NOTA: Poiché le cellule tendono ad accumularsi sulla punta dell'ago, la punta dovrà essere riagganciata leggermente ogni 15-20 iniezioni. Ciò richiederà anche il ripristino della pressione e del tempo ad ogni ritaglio per garantire che venga iniettato un volume simile.
4. Per assicurarsi che il confronto del comportamento di due set distinti di cellule trasferite sia valido, monitorare il bolo delle cellule trasferite. A tale scopo, selezionare gli embrioni in base alla colorazione CM-Dil (nel canale RFP) a 1 ora dopo l'iniezione (hpi), separando quelli con colorazione ottimale ("bolo buono") da quelli con colorazione inferiore ("bolo inferiore"; Figura 3, freccia gialla).
5. Scartare gli embrioni con un bolo inferiore o utilizzarli per valutare l'impatto di una diversa dose di cellule sulla progressione della malattia.
6. Rimuovere gli embrioni morti entro la fine della giornata poiché la loro morte è correlata a un trauma da iniezione piuttosto che alla crescita del tumore. Rimuovere dall'analisi gli embrioni che non trattengono le cellule poiché le cellule probabilmente sono fuoriuscite dal sito di iniezione.
7. Mantenere gli embrioni iniettati a 34 °C per tutta la durata dell'esperimento in una piastra da 90 mm con ~60 embrioni per piastra.
   NOTA: Dopo 5 dpf, il tuorlo sarà stato consumato dagli embrioni in crescita, quindi agli embrioni deve essere fornito cibo paramecium per tutta la durata dell'esperimento. Per garantire una corretta nutrizione, i parameci devono essere somministrati agli embrioni ogni giorno da 6 dpf (4 dpi) a 9 dpf (7 dpi). I parameci si propagano per coltura in fiaschi in condizioni ottimali di nutrizione e temperatura, come descritto³¹.

9. Analisi di sopravvivenza

1. Monitora gli embrioni per i successivi 7 dpi, cambiando l'acqua dell'embrione ogni giorno. I cambi d'acqua possono essere ridotti a giorni alterni per comodità se lo studio prevede un trattamento farmacologico.
2. Controllare la salute dell'embrione e valutare la morte per tutta la durata dell'analisi.
   NOTA: La durata dell'esperimento è stata di 7 giorni per questo esperimento, ma può essere più breve o più lunga a seconda dell'aggressività del tumore xenotrapiantato.
3. Utilizzare la fluorescenza CM-Dil per valutare il carico di malattia (Figura 4A) e determinare l'impatto delle alterazioni genetiche o dei trattamenti farmacologici sulla sopravvivenza utilizzando l'analisi Kaplan Meier e la rappresentazione grafica (ad esempio, con GraphPad Prism; Figura 4B) ³³.

10. Sospensione di embrioni su singola cellula per analisi di citometria a flusso

NOTA: Il carico di malattia può essere valutato mediante analisi di citometria a flusso dopo xenotrapianto; Tuttavia, per farlo è necessaria una marcatura indelebile delle cellule tumorali. La proteina fluorescente rossa (RFP) o mCherry consegnata retrovialmente o lentiviralmente è efficace in quanto fornisce un buon segnale sull'autofluorescenza delle cellule di zebrafish, che oscura il segnale della proteina fluorescente verde.

1. Isolare gli embrioni allo stadio dpi di scelta. Qui viene visualizzato 5 dpi (Figura 5).
2. Raccogli 30-40 embrioni per condizione come punto di partenza, ma il numero di embrioni può variare a seconda dello stadio e dell'aggressività delle cellule trapiantate. Anestetizzare gli embrioni come descritto sopra.
   NOTA: Gli embrioni possono essere suddivisi in repliche per fornire una significatività statistica, come mostrato qui (Figura 5B).
3. Trasferire gli embrioni in provette da centrifuga da 1,5 mL.
4. Utilizzare 100 μl di soluzione di Ringer priva di calcio (ricetta³¹) per campione per sciogliere il tuorlo poiché il basso contenuto di calcio ammorbidisce i tessuti embrionali, consentendo una dissociazione tissutale più efficace.
5. Pipettare su e giù a intermittenza per 5 minuti per rimuovere il tuorlo utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl.
6. Preriscaldare lo 0,05% di tripsina/PBS (senza indicatore rosso fenolo) a 29 °C e integrarlo con 27 μL di collagenasi IV (100 mg/mL) per mL di soluzione di tripsina. Sarà necessario un volume di 1 mL di soluzione per ogni campione di embrioni.
7. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/collagenasi a ciascun campione di embrioni detuolati e incubare a 29 °C per 30-35 minuti.
8. Pipettare gli embrioni su e giù in questa soluzione utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml ogni 5 minuti fino a quando la struttura degli embrioni (spina dorsale) non è più visibile.
9. Arrestare la reazione utilizzando 200 μL di FBS.
10. Mescolare bene e incubare a 29 °C per altri 5 minuti per garantire la completa inattivazione della tripsina.
    NOTA: Una temperatura di 29 °C viene impiegata per il protocollo di dissociazione tissutale per prevenire la morte indotta dallo shock termico delle cellule di zebrafish, che si verifica a 37 °C; tuttavia, se non è richiesta la conservazione delle cellule di zebrafish, la digestione può essere eseguita a 37 °C.
11. Pellettare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
12. Risospendere il pellet della cella in PBS a 4 °C e il pellet come sopra.
13. Ripetere il lavaggio, quindi filtrare le cellule attraverso un colino da 70 μm.
14. Pellet e procedere con la colorazione per l'analisi di citometria a flusso.
    NOTA: Se è necessaria la coltura di cellule primarie di zebrafish, lavare altre due volte con PBS a 4 °C e risospendere in terreno L15 (con antibiotici e FBS al 10%).

11. Selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS): colorazione e selezione di cellule xenotrapiantate

1. Risospendere la sospensione cellulare in un mezzo di colorazione (HBSS con FBS all'1%) e pellettare a 300 x g per 5 minuti.
2. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di colorazione con un anticorpo reattivo con le cellule trapiantate per fornire un secondo marcatore (oltre a RFP o mCherry) con cui distinguere le cellule trapiantate dalle cellule di zebrafish. In questo caso, sono stati impiegati 50 μL di CD45 anti-topo (APC-CD45) per campione a una diluizione di 1:50 (Figura 5).
3. Incubare per 20 minuti a 4 °C prima di lavare come sopra con 1 mL di mezzo colorante per rimuovere l'anticorpo non legato.
4. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 200 μl di mezzo di colorazione contenente il colorante vitale Helix NP Blue (1 μM), che consentirà la distinzione vivo/morto.
5. Trasferire la miscela cellulare in provette in policarbonato a fondo tondo da 5 mL per l'analisi della citometria a flusso.
   NOTA: La colorazione di un controllo di cellule tumorali in parallelo fornisce chiarezza per il disegno dei cancelli durante l'analisi della citometria a flusso.

12. Citometria a flusso

1. Accendere il citometro a flusso disponibile utilizzando una bassa velocità di flusso (500 eventi al secondo o meno) per impostare i parametri.
2. Utilizzare il controllo delle cellule tumorali (le stesse cellule utilizzate per lo xenotrapianto) per impostare la tensione per i canali FSC (forward scatter), SSC (side scatter), BV421/CasB (vitalità), CE-594 (mCherry) e APC (CD45.2).
   NOTA: I campioni colorati singolarmente saranno necessari per stabilire le impostazioni di compensazione che eliminano la sovrapposizione del fluorocromo tra i distinti coloranti.
3. Utilizzare il campione di embrione non iniettato per stabilire impostazioni che accolgano sia le cellule trapiantate che quelle di pesce zebra.
4. Aumenta la velocità di flusso a 8000 eventi al secondo e registra 1 milione di eventi per ogni campione.
5. Analizzare i dati risultanti utilizzando un software di analisi appropriato, selezionando prima i singoletti tracciando FSC-H v/s FSC-A (altezza v/s area), quindi un grafico per la selezione delle celle vitali. Il software FlowJo è ampiamente utilizzato per tale analisi.
6. Utilizzando il controllo delle cellule tumorali, tracciare un cancello attorno alle cellule trapiantate mediante FSC-A v/s SSC-A, quindi utilizzare le colorazioni indicatori, in questo caso, CD45 e mCherry (Figura 5B).
   NOTA: Il cancello dimensionale selezionato per il tumore conterrà anche cellule di zebrafish, che forniscono la base per la normalizzazione e la determinazione del carico di malattia.
7. Analizza i campioni di embrioni utilizzando le stesse impostazioni del cancello di cui sopra. Il grafico finale della colorazione tumorale e l'indicatore della proteina fluorescente forniranno una misura del carico di malattia (Figura 5C).
   NOTA: Qui, la differenza nel carico di malattia è stata tracciata per gli embrioni che ricevono un buon bolo di cellule iniettate rispetto a quelli che ricevono un bolo inferiore.
8. Se necessario, selezionare le cellule tumorali negli embrioni mediante citometria a flusso per l'analisi molecolare a valle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Xenotrapianto
Una visione completa dell'intero esperimento e dell'analisi è illustrata nella Figura 1, che va dalla produzione di embrioni alla valutazione della progressione della malattia mediante analisi della sopravvivenza e del carico di malattia mediante citometria a flusso. Questo approccio apporta diversi miglioramenti che migliorano la riproducibilità e la scalabilità dello xenotrapianto, oltre ad aggiungere un nuovo modo di valutare il carico di malattia. Il ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Lo xenotrapianto di pesce zebra è emerso come un'alternativa rapida, robusta ed economica agli studi sui topi¹². Sebbene siano stati riportati diversi approcci allo xenotrapianto di pesce zebra, il nostro adattamento ha portato a miglioramenti significativi. Oltre a standardizzare i parametri relativi alla procedura, questi miglioramenti si concentrano specificamente sull'accelerazione della velocità con cui possono essere eseguite le iniezioni tumorali, consentendo così un aumento del numero d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763