Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

In-vivo-Studien zum Tumorverhalten sind ein Grundpfeiler der Krebsforschung; Der Einsatz von Mäusen stellt jedoch erhebliche Herausforderungen in Bezug auf Kosten und Zeit dar. Hier stellen wir den larvalen Zebrafisch als Transplantationsmodell vor, das zahlreiche Vorteile gegenüber Mausmodellen hat, darunter einfache Handhabung, geringe Kosten und kurze Versuchsdauer. Darüber hinaus macht das Fehlen eines adaptiven Immunsystems während der Larvenstadien die Notwendigkeit überflüssig, immundefiziente Stämme zu erzeugen und zu verwenden. Während es etablierte Protokolle für die Xenotransplantation in Zebrafischembryonen gibt, stellen wir hier eine verbesserte Methode vor, die das Embryo-Staging für einen schnelleren Transfer, die Überlebensanalyse und den Einsatz von Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Krankheitslast umfasst. Die Embryonen werden in Stadien gesetzt, um eine schnelle Zellinjektion in das Eigelb der Larven und eine Zellmarkierung zu ermöglichen, um die Konsistenz des injizierten Zellbolus zu überwachen. Nach der Injektion wird die Überlebensanalyse des Embryos bis zu 7 Tage nach der Injektion (dpi) bewertet. Schließlich wird auch die Krankheitslast durch Markierung übertragener Zellen mit einem fluoreszierenden Protein und Analyse mittels Durchflusszytometrie bewertet. Die Durchflusszytometrie wird durch eine standardisierte Methode zur Herstellung von Zellsuspensionen aus Zebrafischembryonen ermöglicht, die auch bei der Etablierung der Primärkultur von Zebrafischzellen verwendet werden könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Verfahren eine schnellere Beurteilung des Verhaltens von Tumorzellen in vivo mit einer größeren Anzahl von Tieren pro Studienarm und auf kostengünstigere Weise ermöglicht.

Einleitung

Die Analyse des Verhaltens von Tumoren als Reaktion auf genetische Veränderungen oder medikamentöse Behandlung in vivo ist ein wesentliches Element der Krebsforschung 1,2,3,4. Solche Studien beinhalten meist die Verwendung von immungeschwächten Mausmodellen (Mus musculus)⁵; Xenotransplantationsstudien an Mäusen sind jedoch in vielerlei Hinsicht begrenzt, einschließlich begrenzter Kapazitäten, längerer Dauer, erheblicher Kosten und des Bedarfs an hochentwickelten Bildgebungsgeräten zur Überwachung des....

Protokoll

Die Haltung, Fütterung und Haltung von Zebrafischen erfolgte unter Standard-Aquakulturbedingungen bei 28,5 °C, wie beschrieben³¹. Alle Experimente mit Zebrafischen wurden bei dieser Temperatur durchgeführt; Nach der Xenotransplantation wurden die Tiere jedoch für die Dauer des Versuchs bei 34 °C kultiviert, gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Verfahren.

1. Zucht (3 Tage vor der Injektion)

1. Geben Sie Fischpaaren eine Woche vor der Zucht Trockenfutter (zusätzliches Futter; 5-6 Granulate pro Fisch), um die Tiergesundheit zu maximieren und die Anzahl der....

Diskussion

Die Zebrafisch-Xenotransplantation hat sich als schnelle, robuste und kostengünstige Alternative zu Mausstudien erwiesen¹². Obwohl über mehrere Ansätze zur Zebrafisch-Xenotransplantation berichtet wurde, hat unsere Anpassung zu signifikanten Verbesserungen geführt. Neben der Standardisierung der Parameter rund um das Verfahren konzentrieren sich diese Verbesserungen insbesondere auf die Beschleunigung der Geschwindigkeit, mit der Tumorinjektionen durchgeführt werden können, um so eine Erhöh.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763