Простой, быстрый и эффективный метод анализа ксенотрансплантации опухолей у прозрачных эмбрионов рыбок данио

Резюме

Мы описываем протокол ксенотрансплантации в желток прозрачных эмбрионов данио-рерио, который оптимизируется с помощью простого и быстрого метода стадирования. Постинъекционный анализ включает в себя выживаемость и оценку бремени болезни ксенотрансплантированных клеток с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Исследования поведения опухоли in vivo являются одним из основных элементов исследований рака; Тем не менее, использование мышей сопряжено со значительными проблемами с точки зрения затрат и времени. Здесь мы представляем личинок данио-рерио в качестве модели для трансплантации, которая имеет множество преимуществ по сравнению с мышиными моделями, включая простоту в обращении, низкую стоимость и короткую продолжительность эксперимента. Более того, отсутствие адаптивной иммунной системы на личиночной стадии избавляет от необходимости генерировать и использовать иммунодефицитные штаммы. Несмотря на то, что существуют установленные протоколы ксенотрансплантации эмбрионов рыбок данио, мы представляем здесь усовершенствованный метод, включающий стадирование эмбрионов для более быстрого переноса, анализ выживаемости и использование проточной цитометрии для оценки бремени заболевания. Эмбрионы стадируются для обеспечения быстрой инъекции клеток в желток личинок и маркировки клеток для контроля консистенции вводимого клеточного болюса. После инъекции анализ выживаемости эмбрионов оценивается в течение 7 дней после инъекции (dpi). Наконец, бремя болезни также оценивается путем маркировки перенесенных клеток флуоресцентным белком и анализа с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия стала возможной благодаря стандартизированному методу получения клеточных суспензий из эмбрионов рыбок данио, которые также могут быть использованы для создания первичной культуры клеток рыбок данио. Таким образом, описанная здесь процедура позволяет более быстро оценить поведение опухолевых клеток in vivo с большим числом животных на исследуемую группу и более экономически эффективным способом.

Введение

Анализ поведения опухолей в ответ на генетические изменения или медикаментозное лечение in vivo является важным элементом исследования рака 1,2,3,4. В таких исследованиях чаще всего используются модели мышей с ослабленным иммунитетом (Mus musculus)⁵; Тем не менее, исследования ксенотрансплантации на мышах ограничены во многих отношениях, включая ограниченные возможности, увеличенную продолжительность, значительную стоимость и потребность в сложном оборудовании для визуализации для мониторинга прогрес....

протокол

Содержание, кормление и разведение рыбок данио-рерио происходило в стандартных условиях аквакультуры при температуре 28,5 °C, как описано³¹. Все эксперименты, связанные с рыбками данио, проводились при этой температуре; однако после ксенотрансплантации животных культивировали при температуре 34 °C в течение всего эксперимента в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC).

1. Разведение (за 3 дня до инъекции)

1. Обеспечьте сухими кормами (дополнительный корм; 5-6 гранул на рыбу) пары рыб за неделю до размножения, чтобы ....

Результаты

Ксенотрансплантация
На рисунке 1 представлен полный обзор всего эксперимента и анализа, охватывающего все этапы от производства эмбрионов до оценки прогрессирования заболевания с помощью анализа выживаемости и бремени заболевания с помощью проточной цито?.......

Обсуждение

Ксенотрансплантация данио-рерио стала быстрой, надежной и экономически эффективной альтернативой исследованиям на мышах¹². Несмотря на то, что сообщалось о нескольких подходах к ксенотрансплантации рыбок данио, наша адаптация привела к значительным улучшениям. В дополне?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763