Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Özet

Şeffaf zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ksenotransplantasyon için basit, hızlı bir evreleme yöntemi ile optimize edilmiş bir protokol tarif ediyoruz. Enjeksiyon sonrası analizler, akış sitometrisi ile ksenotransplante edilen hücrelerin sağkalımını ve hastalık yükünün değerlendirilmesini içerir.

Özet

Tümör davranışı üzerine in vivo çalışmalar, kanser araştırmalarının temelini oluşturur; Bununla birlikte, farelerin kullanımı maliyet ve zaman açısından önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, larva zebra balığını, fare modellerine göre kullanım kolaylığı, düşük maliyet ve kısa deney süresi dahil olmak üzere sayısız avantaja sahip bir nakil modeli olarak sunuyoruz. Ayrıca, larva aşamalarında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, immün yetmezliği olan suşların üretilmesi ve kullanılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Zebra balığı embriyolarında ksenotransplantasyon için yerleşik protokoller mevcut olsa da, burada daha hızlı transfer için embriyo evrelemesi, sağkalım analizi ve hastalık yükünü değerlendirmek için akış sitometrisinin kullanımını içeren gelişmiş bir yöntem sunuyoruz. Embriyolar, larvaların sarısına hızlı hücre enjeksiyonunu ve enjekte edilen hücre bolusunun kıvamını izlemek için hücre işaretlemesini kolaylaştırmak için aşamalanır. Enjeksiyondan sonra, embriyo sağkalım analizi, enjeksiyondan 7 gün sonrasına kadar değerlendirilir (dpi). Son olarak, transfer edilen hücrelerin bir floresan proteini ile işaretlenmesi ve akış sitometrisi ile analiz edilmesiyle hastalık yükü de değerlendirilir. Akış sitometrisi, zebra balığı hücrelerinin birincil kültürünün oluşturulmasında da kullanılabilen, zebra balığı embriyolarından hücre süspansiyonlarının hazırlanması için standartlaştırılmış bir yöntemle sağlanır. Özetle, burada açıklanan prosedür, tümör hücrelerinin davranışının in vivo olarak çalışma kolu başına daha fazla sayıda hayvanla ve daha uygun maliyetli bir şekilde daha hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.

Giriş

Genetik değişikliğe veya in vivo ilaç tedavisine yanıt olarak tümörlerin davranışının analizi, kanser araştırmalarının önemli bir unsurudur 1,2,3,4. Bu tür çalışmalar çoğunlukla bağışıklığı baskılanmış fare (Mus musculus) modellerinin^{kullanımını içerir 5}; Bununla birlikte, farelerde ksenotransplantasyon çalışmaları, sınırlı kapasite, uzun süre, önemli masraf ve iç tümörlerin ilerlemesini izlemek için sofistike görüntüleme ekipmanı gereksinimi dahil olmak üzere birçok açıdan sınırlıdır

Protokol

Zebra balığı bakımı, beslenmesi ve yetiştirilmesi,³¹ açıklandığı gibi 28,5 ° C'de standart su ürünleri yetiştiriciliği koşulları altında gerçekleşmiştir. Zebra balığı ile ilgili tüm deneyler bu sıcaklıkta yapıldı; bununla birlikte, ksenotransplantasyonu takiben hayvanlar, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak deney süresince 34 °C'de kültürlendi.

1. Üreme (enjeksiyondan 3 gün önce)

1. Hayvan sağlığını en üst düzeye çıkarmak ve üreme çiftleri tarafından üretilen embriyo sayısını artırmak için üremeden bir hafta önce balık çiftlerine ....

Tartışmalar

Zebra balığı ksenotransplantasyonu, fare çalışmalarına hızlı, sağlam ve uygun maliyetli bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır¹². Zebra balığı ksenotransplantasyonuna yönelik çeşitli yaklaşımlar bildirilmiş olsa da, adaptasyonumuz önemli gelişmelerle sonuçlanmıştır. Prosedürle ilgili parametrelerin standartlaştırılmasına ek olarak, bu iyileştirmeler özellikle tümör enjeksiyonlarının gerçekleştirilme hızını hızlandırmaya odaklanmakta, böylece çalı?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763