一种简单、快速、有效的透明斑马鱼胚胎肿瘤异种移植分析方法

摘要

我们描述了一种将异种移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的方案，该方案通过一种简单、快速的分期方法进行了优化。注射后分析包括存活率和通过流式细胞术评估异种移植细胞的疾病负荷。

摘要

肿瘤行为的体内研究是癌症研究的主要内容;然而，小鼠的使用在成本和时间上提出了重大挑战。在这里，我们将斑马鱼幼虫作为一种移植模型，与鼠类模型相比，该模型具有许多优点，包括易于处理、成本低和实验时间短。此外，在幼虫阶段缺乏适应性免疫系统，因此无需产生和使用免疫缺陷菌株。虽然存在斑马鱼胚胎异种移植的既定方案，但我们在这里提出了一种改进的方法，包括胚胎分期以加快移植、存活分析以及使用流式细胞术评估疾病负担。对胚胎进行分期以促进细胞快速注射到幼虫的卵黄中，并进行细胞标记以监测注射细胞团的一致性。注射后，在注射后 7 天 （dpi） 评估胚胎存活分析。最后，还通过用荧光蛋白标记转移的细胞并通过流式细胞术进行分析来评估疾病负担。流式细胞术是通过从斑马鱼胚胎制备细胞悬液的标准化方法实现的，该方法也可用于建立斑马鱼细胞的原代培养物。总之，此处描述的程序允许更快速地评估肿瘤细胞在体内的行为，每个研究组的动物数量更多，并且以更具成本效益的方式。

引言

分析肿瘤对体内基因改变或药物治疗的反应是癌症研究的基本要素1,2,3,4。此类研究最常涉及使用免疫功能低下的小鼠（Mus musculus）模型⁵;然而，小鼠异种移植研究在许多方面都存在局限性，包括容量有限、持续时间延长、费用高昂以及需要复杂的成像设备来监测内部肿瘤的进展 ^6,7。相比之下，斑马鱼模型（Danio rerio）可实现更大的容量、更短的持续时间、更低的费用，并且由于其透明度，可以简单地监测疾病进展^8,9。

斑马鱼是一种发达的脊椎动物模型系统，具有子宫外发育和高繁殖力，单个雌性产生 100 多个胚胎¹⁰.此外，斑马鱼胚胎是透明的，可以使用荧光相关技术（如报告基因）轻松可视化发育过程。最后，关键发育过程的保守性使它们成为许多类型研究的理想模型，包括移植恶性细胞的行为^11,12。野生型斑马鱼胚胎发育出黑素细胞，使它们在 2 周大时光学不透明，但这已被 casper 胚胎的产生所克服（roy^a9;MITFA^W2），它们在整个生命周期内保持透明¹³.由于其光学特性，卡斯珀斑马鱼是移植肿瘤细胞的理想受体14,15,16。将肿瘤细胞异种移植到斑马鱼中在过去 2 年中变得越来越重要 17,18,19,20,21。斑马鱼胚胎具有先天免疫力;然而，它们在幼虫阶段缺乏适应性免疫，使它们在功能性免疫功能上受损，这使它们能够作为移植肿瘤异种移植物的有效宿主²²。

已经制定了用于斑马鱼胚胎和成虫胚胎中肿瘤植入的方案，这些方案考虑了许多不同的变量 23,24,25,26,27。这些研究探索了斑马鱼肿瘤沉积的许多位点，包括在卵黄、卵黄周间隙和心脏以及不同发育阶段的注射^16,28。斑马鱼异种移植物水产养殖的环境温度也很重要，因为斑马鱼的饲养通常在28°C下进行，而哺乳动物细胞在37°C下生长。 因此，必须采用鱼能耐受但又支持肿瘤生长的折衷温度，而 34 °C 似乎可以实现这两个目标²⁹.异种移植后肿瘤行为和进展的分析是另一个重点领域，这涉及使用各种成像模式以及生存分析³⁰。斑马鱼模型的主要优点之一是可以获得大量研究动物，为肿瘤行为的体内研究提供巨大的统计能力;然而，由于注射需要繁琐的安装程序，以前的方法严重限制了这种潜力。

在这里，我们通过开发一种简单、快速的方法来解决这一限制，该方法可用于分期胚胎，从而实现高通量并使用透明 的casper 斑马鱼系监测注射质量。这需要在受精后 2 天 （dpf） 将异种移植物注射到 casper 斑马鱼胚胎的卵黄囊中。作为肿瘤行为分析的一部分，我们观察异种移植后胚胎的存活情况。我们通过制作单细胞悬浮液和流式细胞术分析进一步展示了异种移植后疾病负担的评估（图1）。

研究方案

斑马鱼的维持、摄食和饲养是在28.5°C的标准水产养殖条件下进行的，如所述³¹。所有与斑马鱼相关的实验都是在这个温度下进行的;然而，在异种移植之后，根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序，在实验期间将动物在34°C下培养。

1.养殖（注射前3天）

1. 在繁殖前一周为鱼对提供干饲料（额外饲料;每条鱼5-6个颗粒），以最大限度地提高动物健康并增加繁殖对产生的胚胎数量。
2. 在胚胎收获的前一天晚上，将繁殖动物设置在繁殖池中，用分隔器将雄性和雌性鱼分开，使用后宫交配，每个雄性2只雌性。
   注意:对于每组 100 只动物的 4 对实验，每个实验使用 20 对育种对。为了确定所需的育种对数量，一个很好的估计是每个 casper 育种对有50个胚胎。另一种选择是采用更坚固的色素斑马鱼品系，并用 1-苯基 2-硫脲 （PTU） 处理以防止色素沉着³¹。在实践中，实验应该扩大规模，以便有足够的胚胎在注射后 1 天 （dpi） 注射两倍于所需数量。

2.胚胎采集（注射前2天）

1. 第二天早上，取下分隔板，让鱼繁殖。
2. 在移除分隔器后 20 分钟（分钟）观察罐中的胚胎。
3. 在含有胚胎水的90毫米培养皿中使用筛子收集胚胎胚胎，如《斑马鱼》^第31册所述。
   1. 要制备胚胎水，将 1.5 mL 储备盐加入 1 L 蒸馏水中，将亚甲蓝加入 0.1% 最终。通过将 40 克海盐（材料表）溶解在 1 升蒸馏水中来制备储备盐溶液。胚胎水的离子组成为K⁺ （0.68 mg/L）、Cl⁻ （31.86 mg/L）、Na⁺ （17.77 mg/L）、SO₄⁻ （4.47 mg/L）、Mg₂⁺ （2.14 mg/L）和_Ca2⁺ （0.68 mg/L）。
4. 让斑马鱼多繁殖一个小时，并收集产生的胚胎。
5. 将胚胎集中进行实验。
6. 晚上，取出所有未受精或死亡的胚胎，这些胚胎可以通过其异常形态来识别，并提供新鲜的胚胎水。

3.胚胎维护和注射工具准备（注射前1天）

1. 第二天早上，取出任何额外的死胚胎，并提供新鲜的胚胎水。
2. 通过在胚胎水中加热1.5%琼脂糖来制备琼脂糖板，并将加热的混合物倒入90mm培养皿中。一个 90 mM 培养皿需要 30-35 mL 的混合物。
3. 使用拉针器从玻璃毛细管（硼硅酸盐）中拉出非丝针。针头被拉动（在热压下），产生一个封闭的一端;用镊子夹住它们以产生最佳孔口。通过确定每单位时间内排出的流体量来评估针孔的适用性（见下文，第 6.3 节）。
   注意:玻璃毛细管可以带或不带中心细丝购买。缺乏中心细丝的毛细管是细胞注射的首选。
4. 将针头放入有盖的90毫米培养皿中，放在用粘土（儿童造型粘土）制成的凹槽中，直至使用（图2A）。

4.用CM-Dil（注射日）制备和标记白血病细胞

1. 将待移植细胞保持在最适合其生长的条件下。这里使用的鼠白血病细胞要么是足够的（M82;Rpl22+/+）或缺乏（M109;Rpl22-/-）为核糖体蛋白Rpl22，其起肿瘤抑制因子³²的作用。
2. 在 50 mL 锥形管中沉淀细胞。计数，然后在室温（RT）下以300× g 离心5分钟。丢弃上清液。
   注意:所需的细胞数量将由实验范围和条件决定，但 1 x 10⁶ 细胞是一个很好的起点。
3. 执行 CM-Dil 染色
   注意:CM-Dil 染色可以监测注射推注。
   1. 通过将 50 μg 小瓶 CM-Dil 重悬于 50 μL 二甲基亚砜 （DMSO;1 mg/mL 或 ~1 mM 最终） 中，制备 CM-Dil 储备溶液。
   2. 通过在含有细胞所需的任何支持性补充剂的 1% 胎牛血清 （FBS）/Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中稀释储备液（4.8 μL 染色剂/mL）来制备工作溶液。
4. 将细胞以 1 x 10⁶/100 μL 重悬于染色剂的工作溶液中。
5. 在37°C孵育10分钟。
   注意:染色条件必须针对所用的细胞（时间等）进行优化。此处使用的细胞需要在不同温度下进行两次不同的 10 分钟孵育，以获得最佳染色。
6. 在室温 （RT） 下用 10 mL 1x HBSS 洗涤。
7. 沉淀细胞（在室温下以 300 x g 离心 5 分钟），倒出上清液，然后用 10 mL HBSS 重悬并重复相同的第二次洗涤。
8. 将染色的肿瘤细胞以 40,000 个细胞/μL 重悬于 1% FBS/PBS 和所需的任何支持性补充剂中，并将细胞悬浮液保持在 34 °C 直至注射。
   注意:需要支持性补充剂来维持本研究中使用的细胞系（例如，1% FBS 和细胞因子）。补充剂和异种移植可能需要适应正在研究的特定细胞系。这里选择PBS而不是培养基，以避免蛋黄中的任何潜在毒性。

5. 疏松

1. 在光学显微镜下，使用胰岛素注射器在2倍放大镜下以2dpf手动对 casper 斑马鱼胚胎进行去毛茸茸。用一根针刺穿绒毛膜，同时用另一根针固定绒毛膜。
   注意:不建议使用鱼跃酶进行去角膜，因为它有时会导致胚胎健康降低。在 2 dpf 时对胚胎进行去角膜是首选，因为它更容易，并且胚胎比早期 （1 dpf） 更不脆弱。
2. 去毛茸茸时，注意不要用针头接触胚胎。因无意中接触针头而触摸或损坏胚胎的卵黄可能会导致死亡。
3. 通过更换胚胎水去除剥离的绒毛膜。

6. 设置显微注射器和针头

1. 打开显微注射器和泵，并设置适合细胞显微注射的条件。9-11 psi 的注射压力和 0.5 秒 （s） 的注射时间是夹住针头和设置孔口的良好起点。
2. 小心地将肿瘤细胞系悬浮液 （~5 μL） 一次性加载到微针中，避免形成气泡，这会破坏针内的细胞流。
3. 用镊子（Dumont 5 号）切开针头的末端以产生一个孔口，该孔口将支持每 0.2-0.3 秒喷射 10-15 纳升 （nL） 细胞悬浮液。
   注意:上述 nL 体积的计算是使用校准毛细管完成的，其中 1 mm = 30 nL。简而言之，将时间设置为 0.5 秒，每次夹针后，按压注入并在校准毛细管中收集体积。然后，在显微镜下使用刻度测量收集体积的长度，并在0.5秒内注射30nL时停止针夹。然后，将注射时间设置为 0.2-0.3 秒（注射 ~10-15 nL 细胞）

7. 胚胎注射准备

1. 在显微镜下选择健康的胚胎，剔除任何有发育异常的胚胎，如心脏水肿或躯干短或弯曲。
2. 在90mm培养皿中使用甲磺酸三卡因（MS-222;0.16g / L胚胎水）麻醉胚胎1分钟。
3. 使用玻璃巴斯德移液管吸取胚胎。将10-15个胚胎在1.5%琼脂糖平板上横向排列（图2B-D）。
4. 使用巴斯德移液管去除多余的水，留下保持胚胎存活所需的最少量胚胎水。

8. 注射程序

1. 在光学显微镜下检查，确保细胞已积聚在针尖中。
2. 使用校准的针头将胚胎注射0.2-0.3秒（10-15nL对应于400-600个细胞）在胚胎的卵黄中。
3. 对所有胚胎重复注射，然后将它们收集在新鲜的胚胎水中。
   注意:由于细胞往往会积聚在针尖上，因此每注射 15-20 次时需要稍微重新夹住针尖。这还需要在每次重新夹紧时重置压力和时间，以确保注入相似的体积。
4. 为确保两组不同转移细胞的行为比较是有效的，请监测转移细胞的推注。通过在注射后 1 小时 （hpi） 根据 CM-Dil 染色（在 RFP 通道中）对胚胎进行分选来做到这一点，将具有最佳染色（"良好推注"）的胚胎与具有较差染色（"劣质推注"; 图3，黄色箭头）。
5. 丢弃劣质团块的胚胎，或使用它们来评估不同细胞剂量对疾病进展的影响。
6. 在一天结束时取出任何死去的胚胎，因为它们的死亡与注射创伤有关，而不是肿瘤生长。从分析中取出不保留细胞的胚胎，因为细胞可能从注射部位泄漏出来。
7. 在实验期间，将注射的胚胎保持在34°C，在90mm培养皿中，每个培养皿有~60个胚胎。
   注意:5 dpf 后，卵黄将被生长中的胚胎消耗掉，因此在实验期间必须为胚胎提供草履虫食物。为确保适当的营养，草履虫应每天给胚胎注射 6 dpf （4 dpi） 至 9 dpf （7 dpi）。草履虫是通过在最佳营养和温度条件下在烧瓶中培养来繁殖的，如所述³¹。

9. 生存分析

1. 监测胚胎接下来的 7 dpi，每天更换胚胎水。为方便起见，如果研究涉及药物治疗，换水时间可以减少到隔天。
2. 在分析期间检查胚胎健康状况并对死亡进行评分。
   注意:该实验的实验持续时间为 7 天，但根据异种移植肿瘤的侵袭性，实验持续时间可能更短或更长。
3. 使用CM-Dil荧光评估疾病负担（图4A），并使用Kaplan Meier分析确定基因改变或药物治疗对生存率的影响，并以图形方式描述（例如，使用GraphPad Prism; 图4B）³³.

10. 用于流式细胞术分析的胚胎单细胞悬浮液

注意:疾病负担可以通过异种移植后的流式细胞术分析来评估;然而，这样做需要对肿瘤细胞进行不可磨灭的标记。逆转录病毒或慢病毒递送的红色荧光蛋白 （RFP） 或 mCherry 是有效的，因为它在斑马鱼细胞的自发荧光上提供了良好的信号，从而掩盖了绿色荧光蛋白的信号。

1. 在选择的dpi阶段分离胚胎。此处显示 5 dpi（图 5）。
2. 每种条件收集 30-40 个胚胎作为起点，但胚胎数量可能因移植细胞的阶段和侵袭性而异。如上所述麻醉胚胎。
   注意:胚胎可以细分为重复以提供统计显着性，如此处所示（图5B）。
3. 将胚胎转移到 1.5 mL 离心管中。
4. 每个样品使用 100 μL 无钙林格氏溶液（配方³¹）溶解蛋黄，因为低钙会软化胚胎组织，从而实现更有效的组织解离。
5. 间歇地上下移液器 5 分钟，使用 200 μL 移液器吸头去除蛋黄。
6. 将0.05%胰蛋白酶/ PBS（不含酚红指示剂）预热至29°C，并补充每mL胰蛋白酶溶液27μL胶原酶IV（100mg / mL）。每个胚胎样本需要 1 mL 溶液的体积。
7. 向每个脱黄胚胎样品中加入1mL胰蛋白酶/胶原酶溶液，并在29°C下孵育30-35分钟。
8. 每 5 分钟使用 1 mL 移液器吸头在该溶液中上下移液胚胎，直到胚胎的结构（骨架）不再可见。
9. 使用 200 μL FBS 终止反应。
10. 充分混合并在29°C下再孵育5分钟，以确保胰蛋白酶完全失活。
    注:组织解离方案采用29°C的温度，以防止热休克诱导的斑马鱼细胞死亡，亡发生在37°C时;但是，如果不需要保存斑马鱼细胞，则可以在37°C下进行消化。
11. 在4°C下以300× g 沉淀细胞悬浮液5分钟，并弃去上清液。
12. 将细胞沉淀重悬于4°C PBS中，并如上所述沉淀。
13. 重复洗涤，然后通过70μm细胞过滤器过滤细胞。
14. 沉淀并进行染色以进行流式细胞术分析。
    注意:如果需要培养原代斑马鱼细胞，用4°C PBS再洗涤两次，并重悬于L15培养基（用抗生素和10%FBS）中。

11. 荧光激活细胞分选（FACS）:异种移植细胞的染色和分选

1. 将细胞悬浮液重悬于染色培养基（含1%FBS）中，并以300× g 沉淀5分钟。
2. 用与移植细胞反应的抗体将细胞沉淀重悬于染色培养基中，以提供第二个标记物（除了 RFP 或 mCherry）以区分移植细胞和斑马鱼细胞。在这里，每个样品采用50μL抗小鼠CD45（APC-CD45），稀释度为1:50（图5）。
3. 在4°C下孵育20分钟，然后如上所述用1mL染色培养基洗涤以除去未结合的抗体。
4. 丢弃上清液后，将细胞沉淀重悬于含有重要染料 Helix NP Blue （1 μM） 的 200 μL 染色培养基中，这将能够区分活/死。
5. 将细胞混合物转移到 5 mL 圆底聚碳酸酯管中进行流式细胞术分析。
   注:平行对肿瘤细胞对照进行染色可使流式细胞术分析期间的拉样门清晰。

12. 流式细胞术

1. 打开可以使用低流速（每秒 500 个事件或更少）的流式细胞仪来设置参数。
2. 使用肿瘤细胞对照（用于异种移植的相同细胞）设置 FSC（前向散射）、SSC（侧向散射）、BV421/CasB（活力）、CE-594（mCherry）和 APC（CD45.2）通道的电压。
   注意:需要对单独染色的样品进行建立补偿设置，以消除不同染色剂之间的荧光染料重叠。
3. 使用未注射的胚胎样本建立适合移植细胞和斑马鱼细胞的设置。
4. 将流速提高到每秒 8000 个事件，并为每个样本记录 100 万个事件。
5. 使用适当的分析软件分析结果数据，首先通过绘制 FSC-H 与 FSC-A（高度与 s 面积）来选择单峰，然后绘制用于选择活细胞的图。FlowJo 软件被广泛用于此类分析。
6. 使用肿瘤细胞对照，通过FSC-A vs / s SSC-A在移植细胞周围绘制一个门，然后使用指示剂染色剂，在本例中为CD45和mCherry（图5B）。
   注意:为肿瘤选择的大小门也将包含斑马鱼细胞，这为标准化和确定疾病负荷提供了基础。
7. 使用与上述相同的门设置分析胚胎样品。肿瘤染色和荧光蛋白指示剂的最终图将提供疾病负担的量度（图5C）。
   注:在这里，绘制了接受良好注射细胞团的胚胎与接受较差团肥的胚胎的疾病负担差异。
8. 如果需要，通过流式细胞术对胚胎中的肿瘤细胞进行分选，以进行下游分子分析。

结果

异种移植
图1描绘了整个实验和分析的全面视图，从胚胎生产到通过流式细胞术分析生存和疾病负担分析来评估疾病进展。这种方法带来了一些改进，提高了异种移植的可重复性和可扩展性，并增加了一种评估疾病负担的新方法。这些实验的成功在很大程度上取决于移植细胞的健康状况，因为不健康且处于对数期的细胞在移植时无法繁殖。注射会话的持续时间...

讨论

斑马鱼异种移植已成为小鼠研究的一种快速、稳健且具有成本效益的替代方案¹².尽管已经报道了几种斑马鱼异种移植方法，但我们的适应已经带来了显着的改进。除了标准化程序的参数外，这些改进还特别侧重于加快肿瘤注射的速度，从而增加每个研究组的动物数量，并使用肿瘤标记来监测注射质量和注射后行为。

虽然这里描述的对这种方法的改进具有很?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763