一种简单、快速、有效的透明斑马鱼胚胎肿瘤异种移植分析方法

摘要

我们描述了一种将异种移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的方案，该方案通过一种简单、快速的分期方法进行了优化。注射后分析包括存活率和通过流式细胞术评估异种移植细胞的疾病负荷。

摘要

肿瘤行为的体内研究是癌症研究的主要内容;然而，小鼠的使用在成本和时间上提出了重大挑战。在这里，我们将斑马鱼幼虫作为一种移植模型，与鼠类模型相比，该模型具有许多优点，包括易于处理、成本低和实验时间短。此外，在幼虫阶段缺乏适应性免疫系统，因此无需产生和使用免疫缺陷菌株。虽然存在斑马鱼胚胎异种移植的既定方案，但我们在这里提出了一种改进的方法，包括胚胎分期以加快移植、存活分析以及使用流式细胞术评估疾病负担。对胚胎进行分期以促进细胞快速注射到幼虫的卵黄中，并进行细胞标记以监测注射细胞团的一致性。注射后，在注射后 7 天 （dpi） 评估胚胎存活分析。最后，还通过用荧光蛋白标记转移的细胞并通过流式细胞术进行分析来评估疾病负担。流式细胞术是通过从斑马鱼胚胎制备细胞悬液的标准化方法实现的，该方法也可用于建立斑马鱼细胞的原代培养物。总之，此处描述的程序允许更快速地评估肿瘤细胞在体内的行为，每个研究组的动物数量更多，并且以更具成本效益的方式。

引言

分析肿瘤对体内基因改变或药物治疗的反应是癌症研究的基本要素1,2,3,4。此类研究最常涉及使用免疫功能低下的小鼠（Mus musculus）模型⁵;然而，小鼠异种移植研究在许多方面都存在局限性，包括容量有限、持续时间延长、费用高昂以及需要复杂的成像设备来监测内部肿瘤的进展 ^6,7。相比之下，斑马鱼模型（Danio rerio）可实现更大的容量、更短的持续时间、更低的费用，并且由于其透明度，可以简单地监测疾病进展^8,9。

斑马鱼是一种发达的脊椎动物模型系统，具有子宫外发育和高繁殖力，单个雌性产生 100 多个胚胎¹⁰.此外，斑马鱼胚胎是透明的，可以使用荧光相关技术（如报告基因）轻松可视化发育过程。最后，关键发育过程的保守性使它们成为许多类型研究的....

研究方案

斑马鱼的维持、摄食和饲养是在28.5°C的标准水产养殖条件下进行的，如所述³¹。所有与斑马鱼相关的实验都是在这个温度下进行的;然而，在异种移植之后，根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序，在实验期间将动物在34°C下培养。

1.养殖（注射前3天）

1. 在繁殖前一周为鱼对提供干饲料（额外饲料;每条鱼5-6个颗粒），以最大限度地提高动物健康并增加繁殖对产生的胚胎数量。
2. 在胚胎收获的前一天晚上，将繁殖动物设置在繁殖池中，用分隔器将雄性和雌性鱼分开，使用后宫交配，每个雄性2只雌性。
   注意：对于每组 100 只动物的 4 对实验，每个实验使用 20 对育种对。为了确定所需的育种对数量，一个很好的估计是每个 casper 育种对有50个胚胎。另一种选择是采用更坚固的色素斑马鱼品系，并用 1-苯基 2-硫脲 （PTU） 处理以防止色素沉着³¹。在实践中，实验应该扩大规模，以便有足够的胚胎在注射后 1 天 （dpi） 注射两倍于所需数量。

2.胚胎采集（注射前2天）

1. 第二天早上，取下分隔板，让鱼繁殖。
2. 在移除分隔器后 20 分钟（分钟）观察罐中的胚胎。....

讨论

斑马鱼异种移植已成为小鼠研究的一种快速、稳健且具有成本效益的替代方案¹².尽管已经报道了几种斑马鱼异种移植方法，但我们的适应已经带来了显着的改进。除了标准化程序的参数外，这些改进还特别侧重于加快肿瘤注射的速度，从而增加每个研究组的动物数量，并使用肿瘤标记来监测注射质量和注射后行为。

虽然这里描述的对这种方法的改进具有很?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763