Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Resumo

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Resumo

Estudos in vivo do comportamento do tumor são um elemento básico da pesquisa do câncer; no entanto, o uso de camundongos apresenta desafios significativos em custo e tempo. Aqui, apresentamos o peixe-zebra larval como um modelo de transplante que apresenta inúmeras vantagens sobre os modelos murinos, incluindo facilidade de manuseio, baixo custo e curta duração experimental. Além disso, a ausência de um sistema imunológico adaptativo durante os estágios larvais evita a necessidade de gerar e usar cepas imunodeficientes. Embora existam protocolos estabelecidos para xenotransplante em embriões de peixe-zebra, apresentamos aqui um método aprimorado envolvendo o estadiamento embrionário para transferência mais rápida, análise de sobrevivência e o uso de citometria de fluxo para avaliar a carga da doença. Os embriões são preparados para facilitar a injeção rápida de células na gema das larvas e a marcação celular para monitorar a consistência do bolo celular injetado. Após a injeção, a análise de sobrevivência do embrião é avaliada até 7 dias após a injeção (dpi). Finalmente, a carga da doença também é avaliada marcando as células transferidas com uma proteína fluorescente e análise por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é possibilitada por um método padronizado de preparação de suspensões celulares de embriões de peixe-zebra, que também pode ser usado no estabelecimento da cultura primária de células de peixe-zebra. Em resumo, o procedimento descrito aqui permite uma avaliação mais rápida do comportamento das células tumorais in vivo com maior número de animais por braço de estudo e de maneira mais econômica.

Introdução

A análise do comportamento dos tumores em resposta à alteração genética ou ao tratamento medicamentoso in vivo é um elemento essencial da pesquisa do câncer 1,2,3,4. Tais estudos geralmente envolvem o uso de modelos de camundongos imunocomprometidos (Mus musculus)⁵; No entanto, os estudos de xenotransplante em camundongos são limitados em muitos aspectos, incluindo capacidade limitada, duração prolongada, despesas significativas e a necessidade de equipamentos de imagem sofisticados para monitorar a progressão de tumores internos ^6,7. Por outro lado, o modelo zebrafish (Danio rerio) permite maior capacidade, menor duração, menor gasto e, devido à sua transparência, monitoramento simples da progressão da doença ^8,9.

O peixe-zebra é um sistema modelo de vertebrado bem desenvolvido com desenvolvimento ex-útero e alta fecundidade, com fêmeas individuais produzindo mais de 100 embriões¹⁰. Além disso, os embriões de peixe-zebra são transparentes, permitindo fácil visualização dos processos de desenvolvimento usando técnicas relacionadas à fluorescência, como repórteres. Finalmente, a conservação de processos críticos de desenvolvimento os torna um modelo ideal para muitos tipos de estudos, incluindo o comportamento de células malignas transplantadas ^11,12. Os embriões de peixe-zebra do tipo selvagem desenvolvem melanócitos, que os tornam opticamente opacos às 2 semanas de idade, mas isso foi superado pela geração de embriões de casper (roy^a9; mitfa^w2), que permanecem transparentes ao longo da vida¹³. Devido às suas propriedades ópticas, o peixe-zebra casper é um receptor ideal de células tumorais transplantadas 14,15,16. O xenotransplante de células tumorais em peixe-zebra ganhou importância nas últimas 2 décadas 17,18,19,20,21. Os embriões de peixe-zebra têm imunidade inata; no entanto, eles carecem de imunidade adaptativa durante o estágio larval, tornando-os funcionalmente imunocomprometidos, o que lhes permite servir como hospedeiros eficazes para xenoenxertos tumorais transplantados²².

Protocolos foram desenvolvidos para enxerto tumoral em embriões de peixe-zebra, bem como em adultos, que consideraram uma série de variáveis diferentes 23,24,25,26,27. Estes exploraram vários locais de deposição tumoral em peixe-zebra, incluindo injeções na gema, espaço perivitelino e coração e em diferentes estágios de desenvolvimento ^16,28. A temperatura ambiente da aquicultura para xenoenxertos de peixe-zebra também é importante, pois a criação de peixe-zebra normalmente ocorre a 28 ° C, enquanto as células de mamíferos crescem a 37 ° C. Consequentemente, uma temperatura de compromisso deve ser empregada que seja tolerada pelos peixes, mas que suporte o crescimento do tumor, e 34 ° C parece atingir ambos os objetivos²⁹. A análise do comportamento e progressão dos tumores após o xenotransplante é outra área importante de foco, e isso envolve o uso de uma variedade de modalidades de imagem, bem como a análise de sobrevida³⁰. Uma das principais vantagens do modelo de peixe-zebra é a disponibilidade de um grande número de animais de estudo para fornecer imenso poder estatístico aos estudos in vivo do comportamento do tumor; no entanto, as abordagens anteriores limitaram severamente esse potencial devido à necessidade de procedimentos de montagem tediosos para injeções.

Aqui, abordamos essa limitação por meio do desenvolvimento de um método simples e rápido para estadiar embriões que permite alto rendimento e monitoramento da qualidade da injeção usando a linha transparente de peixe-zebra. Isso envolve a injeção de xenoenxertos no saco vitelino dos embriões de peixe-zebra casper 2 dias após a fertilização (dpf). Observamos a sobrevivência de embriões após xenotransplante como parte da análise do comportamento tumoral. Mostramos ainda a avaliação da carga da doença após o xenotransplante por meio de suspensões de células únicas e análise por citometria de fluxo (Figura 1).

Protocolo

A manutenção, alimentação e criação do peixe-zebra ocorreram em condições padrão de aquicultura a 28,5 ° C, conforme descrito³¹. Todos os experimentos relacionados ao peixe-zebra foram feitos nessa temperatura; no entanto, após o xenotransplante, os animais foram cultivados a 34 °C durante o experimento, de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Reprodução (3 dias antes da injeção)

1. Forneça ração seca (ração extra; 5-6 grânulos por peixe) aos pares de peixes uma semana antes da reprodução para maximizar a saúde animal e aumentar o número de embriões produzidos pelos casais reprodutores.
2. Na noite anterior à colheita do embrião, coloque os animais reprodutores em tanques de reprodução com uma divisória separando os peixes machos e fêmeas, usando acasalamentos de harém de 2 fêmeas para cada macho.
   NOTA: Para experimentos com 4 braços de 100 animais por braço, empregue 20 casais reprodutores por experimento. Para determinar o número de casais reprodutores necessários, uma boa estimativa é de 50 embriões por casal reprodutor de casper . Outra opção é empregar uma cepa de peixe-zebra mais robusta e pigmentada e tratar com 1-fenil 2-tioureia (PTU) para prevenir a pigmentação³¹. Na prática, o experimento deve ser dimensionado de forma que se tenha embriões suficientes para injetar o dobro do número desejado 1 dia após a injeção (dpi).

2. Coleta de embriões (2 dias antes da injeção)

1. Na manhã seguinte, remova as divisórias, permitindo que os peixes se reproduzam.
2. Visualize os embriões nos tanques 20 minutos (min) após a remoção dos divisores.
3. Colete os embriões usando uma peneira em uma placa de Petri de 90 mm contendo água de embriões feita conforme descrito no The Zebrafish Book³¹.
   1. Para fazer água embrionária, adicione 1,5 mL de sais de estoque a 1 L de água destilada e azul de metileno a 0,1% final. Faça a solução salina de estoque dissolvendo 40 g de sais marinhos (Tabela de Materiais) em 1 L de água destilada. A composição iônica da água embrionária é K⁺ (0,68 mg/L), Cl⁻ (31,86 mg/L), Na⁺ (17,77 mg/L), SO₄⁻ (4,47 mg/L), Mg₂⁺ (2,14 mg/L) e Ca₂⁺ (0,68 mg/L).
4. Deixe o peixe-zebra se reproduzir por mais uma hora e colete os embriões resultantes.
5. Agrupe os embriões para o experimento.
6. À noite, remova todos os embriões não fertilizados ou mortos, que são reconhecíveis por sua morfologia anormal, e forneça água fresca para os embriões.

3. Manutenção do embrião e preparação da ferramenta para injeções (1 dia antes da injeção)

1. Na manhã seguinte, remova quaisquer embriões mortos adicionais e forneça água fresca para o embrião.
2. Prepare uma placa de agarose aquecendo 1,5% de agarose em água de embrião e despeje a mistura aquecida em uma placa de Petri de 90 mm. Um prato de 90 mm requer 30-35 mL da mistura.
3. Puxe agulhas sem filamento de capilares de vidro (borossilicato) usando o extrator de agulhas. As agulhas são puxadas (sob pressão de calor) produzindo uma extremidade fechada; Prenda-os com uma pinça para gerar um orifício ideal. Avalie a adequação do orifício da agulha determinando o volume de fluido deslocado por unidade de tempo (ver abaixo, secção 6.3).
   NOTA: Os capilares de vidro podem ser adquiridos com ou sem filamentos centrais. Os capilares sem filamentos centrais são preferidos para injeções de células.
4. Colocar as agulhas em uma placa de Petri de 90 mm coberta nas ranhuras feitas com argila (argila de modelar kids) até o uso (Figura 2A).

4. Preparação e marcação de células de leucemia com CM-Dil (dia da injeção)

1. Manter as células a serem transplantadas em condições ideais para seu crescimento. As células de leucemia murina empregadas aqui foram suficientes (M82; Rpl22+/+) ou deficiente (M109; Rpl22-/-) para a proteína ribossômica Rpl22, que funciona como um supressor tumoral³².
2. Células de pellets em um tubo cônico de 50 mL. Contar e centrifugar a 300 x g à temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Descarte o sobrenadante.
   NOTA: O número de células necessárias será ditado pelo escopo e condições experimentais, mas 1 x 10⁶ células é um bom ponto de partida.
3. Realize a coloração CM-Dil
   NOTA: A coloração CM-Dil permite o monitoramento do bolus de injeção.
   1. Faça uma solução estoque de CM-Dil ressuspendendo um frasco de 50 μg de CM-Dil em 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mg / mL ou ~ 1 mM final).
   2. Produza uma solução de trabalho diluindo o estoque (4,8 μL de corante/mL) em soro fetal bovino a 1% (FBS)/solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo quaisquer suplementos de suporte necessários para as células a serem usadas.
4. Ressuspenda as células a 1 x 10⁶/100 μL na solução de trabalho da mancha.
5. Incubar a 37 °C durante 10 min.
   NOTA: As condições de coloração devem ser otimizadas para as células empregadas (tempo, etc). As células usadas aqui exigiram duas incubações distintas de 10 minutos em diferentes temperaturas para obter a coloração ideal.
6. Lavar com 10 mL de 1x HBSS à temperatura ambiente (RT).
7. Células de pellets (centrifugação a 300 x g por 5 min em RT), decantar o sobrenadante, depois ressuspender com 10 mL de HBSS e repetir o mesmo para uma segunda lavagem.
8. Ressuspenda as células tumorais coradas a 40.000 células/μL em 1% de FBS/PBS e quaisquer suplementos de suporte necessários e mantenha a suspensão celular a 34 °C até a injeção.
   NOTA: Suplementos de suporte foram necessários para a manutenção das linhagens celulares usadas neste estudo (por exemplo, 1% de FBS e citocinas). Os suplementos e o xenotransplante podem precisar ser adaptados às linhagens celulares específicas em estudo. O PBS foi selecionado aqui em vez de meio para evitar qualquer toxicidade potencial na gema.

5. Descorionação

1. Descorionate os embriões de peixe-zebra casper manualmente a 2 dpf usando seringas de injeção de insulina com ampliação de 2x em um microscópio de luz. Perfure o córion com uma agulha enquanto usa a outra agulha para imobilizar o córion.
   NOTA: O uso de pronase para descorionação não é recomendado porque às vezes resulta em redução da saúde do embrião. A descorionização dos embriões a 2 dpf é preferível porque é mais fácil e os embriões são menos frágeis do que em épocas anteriores (1 dpf).
2. Durante a descorionização, tome cuidado para não tocar nos embriões com as agulhas. Tocar ou danificar a gema dos embriões por contato inadvertido com as agulhas pode causar a morte.
3. Remova os córions descascados trocando a água do embrião.

6. Configurando o microinjetor e a agulha

1. Ligue o microinjetor e a bomba e configure as condições adequadas para microinjeções de células. Uma pressão de injeção de 9-11 psi e um tempo de injeção de 0,5 segundos (s) são um bom ponto de partida para cortar a agulha e ajustar o orifício.
2. Carregue a suspensão da linha de células tumorais (~ 5 μL) na microagulha cuidadosamente em uma única passagem, evitando a formação de bolhas de ar, que interromperão o fluxo celular dentro da agulha.
3. Corte a ponta da agulha com uma pinça (Dumont número 5) para produzir um orifício que suportará a ejeção de 10-15 nanolitros (nL) de suspensão celular por 0,2-0,3 s.
   NOTA: O cálculo acima do volume de nL é feito usando capilares de calibração, onde 1 mm = 30 nL. Em resumo, defina o tempo para 0,5 s e, após cada clipe da agulha, pressione injetar e colete o volume no capilar de calibração. Em seguida, o comprimento do volume coletado é medido usando a escala ao microscópio e o corte da agulha é interrompido quando 30 nL são injetados em 0,5 s. Em seguida, defina o tempo de injeções como 0,2-0,3 s. (injetando ~ 10-15 nL de células)

7. Preparação de embriões para injeção

1. Selecione embriões saudáveis ao microscópio, eliminando qualquer um com anomalias de desenvolvimento, como edema cardíaco ou tronco curto ou curvo.
2. Anestesiar os embriões com metanossulfonato de tricaína (MS-222; 0,16 g/L de água embrionária) por 1 min em uma placa de Petri de 90 mm.
3. Use uma pipeta de vidro Pasteur para pegar os embriões. Organize 10-15 embriões em posição lateral na placa de agarose a 1,5% (Figura 2B-D).
4. Remova o excesso de água usando a pipeta Pasteur, deixando a quantidade mínima de água embrionária necessária para manter os embriões vivos.

8. Procedimento de injeção

1. Verifique sob o microscópio óptico para garantir que as células se acumularam na ponta da agulha.
2. Injete os embriões usando a agulha calibrada por 0,2-0,3 s (com 10-15 nL correspondendo a 400-600 células) na gema dos embriões.
3. Repita a injeção para todos os embriões e colete-os em água fresca para embriões.
   NOTA: Como as células tendem a se acumular na ponta da agulha, a ponta precisará ser recortada ligeiramente a cada 15-20 injeções. Isso também exigirá a redefinição da pressão e do tempo a cada recorte para garantir que um volume semelhante seja injetado.
4. Para garantir que a comparação do comportamento de dois conjuntos distintos de células transferidas seja válida, monitore o bolo de células transferidas. Faça isso classificando os embriões com base na coloração CM-Dil (no canal RFP) 1 hora após a injeção (hpi), separando aqueles com coloração ideal ("bolo bom") daqueles com coloração inferior ("bolo inferior"; Figura 3, seta amarela).
5. Descarte os embriões com um bolo inferior ou use-os para avaliar o impacto de uma dose celular diferente na progressão da doença.
6. Remova todos os embriões mortos até o final do dia, pois sua morte está relacionada ao trauma da injeção, e não ao crescimento do tumor. Remova da análise embriões que não retêm células, pois as células provavelmente vazaram do local da injeção.
7. Manter os embriões injectados a 34 °C durante a experiência numa placa de 90 mm com ~60 embriões por placa.
   NOTA: Após 5 dpf, a gema terá sido consumida pelos embriões em crescimento, portanto, os embriões devem receber alimento paramécio durante o experimento. Para garantir uma nutrição adequada, a paramécia deve ser administrada aos embriões diariamente de 6 dpf (4 dpi) a 9 dpf (7 dpi). Os paramécios são propagados por cultura em frascos em condições ideais de nutrição e temperatura, conforme descrito³¹.

9. Análise de sobrevivência

1. Monitore os embriões pelos próximos 7 dpi, trocando a água do embrião diariamente. As trocas de água podem ser reduzidas para dias alternados por conveniência se o estudo envolver tratamento medicamentoso.
2. Verifique a saúde do embrião e marque a morte durante a análise.
   NOTA: A duração experimental foi de 7 dias para este experimento, mas pode ser menor ou mais longa, dependendo da agressividade do tumor xenotransplantado.
3. Use a fluorescência CM-Dil para avaliar a carga da doença (Figura 4A) e determinar o impacto de alterações genéticas ou tratamentos medicamentosos na sobrevida usando a análise de Kaplan Meier e represente graficamente (por exemplo, com GraphPad Prism; Figura 4B) ³³.

10. Suspensão unicelular de embriões para análise por citometria de fluxo

NOTA: A carga da doença pode ser avaliada por análise de citometria de fluxo após xenotransplante; no entanto, isso requer uma marcação indelével das células tumorais. A proteína fluorescente vermelha (RFP) ou mCherry fornecida retroviral ou lentiviralmente é eficaz, pois fornece um bom sinal sobre a autofluorescência das células do peixe-zebra, o que obscurece o sinal da proteína fluorescente verde.

1. Isole os embriões no estágio dpi de escolha. 5 dpi são exibidos aqui (Figura 5).
2. Reúna de 30 a 40 embriões por condição como ponto de partida, mas o número de embriões pode diferir dependendo do estágio e da agressividade das células transplantadas. Anestesiar os embriões conforme descrito acima.
   NOTA: Os embriões podem ser subdivididos em réplicas para fornecer significância estatística, conforme mostrado aqui (Figura 5B).
3. Transfira os embriões para tubos de centrífuga de 1,5 mL.
4. Use 100 μL de solução de Ringer sem cálcio (receita³¹) por amostra para dissolver a gema, pois o baixo teor de cálcio amolece os tecidos embrionários, permitindo uma dissociação mais eficaz dos tecidos.
5. Pipete para cima e para baixo intermitentemente por 5 min para remover a gema usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
6. Pré-aqueça 0,05% de tripsina / PBS (sem indicador de vermelho de fenol) a 29 ° C e complemente-o com 27 μL de colagenase IV (100 mg / mL) por mL de solução de tripsina. Será necessário um volume de 1 mL de solução para cada amostra de embriões.
7. Adicionar 1 ml da solução de tripsina/colagenase a cada amostra de embriões vitelinos e incubar a 29 °C durante 30-35 min.
8. Pipete os embriões para cima e para baixo nesta solução usando uma ponta de pipeta de 1 mL a cada 5 minutos até que a estrutura dos embriões (espinha dorsal) não seja mais visível.
9. Pare a reação usando 200 μL de FBS.
10. Misturar bem e incubar a 29 °C durante mais 5 minutos para garantir a inativação completa da tripsina.
    NOTA: Uma temperatura de 29 ° C é empregada para o protocolo de dissociação tecidual para evitar a morte induzida por choque térmico de células de peixe-zebra, que ocorre a 37 ° C; no entanto, se a preservação das células do peixe-zebra não for necessária, a digestão pode ser realizada a 37 °C.
11. Pulverizar a suspensão celular a 300 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
12. Ressuspenda o pellet da célula em PBS a 4 °C e o pellet como acima.
13. Repita a lavagem e, em seguida, coe as células através de um filtro de células de 70 μm.
14. Pastilha e prossiga com a coloração para análise de citometria de fluxo.
    NOTA: Se for necessária a cultura de células primárias de peixe-zebra, lave mais duas vezes com PBS a 4 °C e ressuspenda em meio L15 (com antibióticos e FBS a 10%).

11. Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS): Coloração e classificação de células xenotransplantadas

1. Ressuspenda a suspensão celular em um meio de coloração (HBSS com 1% de FBS) e pellet a 300 x g por 5 min.
2. Ressuspenda o pellet celular no meio de coloração com um anticorpo reativo com as células transplantadas para fornecer um segundo marcador (além de RFP ou mCherry) com o qual distinguir células transplantadas de células de peixe-zebra. Aqui, 50 μL de CD45 anti-camundongo (APC-CD45) por amostra foram empregados em uma diluição de 1:50 (Figura 5).
3. Incubar durante 20 min a 4 °C antes de lavar como acima com 1 ml do meio de coloração para remover o anticorpo não ligado.
4. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 200 μL de meio de coloração contendo o corante vital Helix NP Blue (1 μM), o que permitirá a discriminação de vivos / mortos.
5. Transfira a mistura de células para tubos de policarbonato de fundo redondo de 5 mL para análise de citometria de fluxo.
   NOTA: A coloração de um controle de célula tumoral em paralelo fornece clareza para desenhar portas durante a análise de citometria de fluxo.

12. Citometria de fluxo

1. Ligue o citômetro de fluxo disponível usando uma taxa de fluxo baixa (500 eventos por segundo ou menos) para definir os parâmetros.
2. Use o controle de células tumorais (as mesmas células usadas para xenotransplante) para definir a voltagem para os canais FSC (dispersão direta), SSC (dispersão lateral), BV421 / CasB (viabilidade), CE-594 (mCherry) e APC (CD45.2).
   NOTA: Amostras coradas individualmente serão necessárias para estabelecer as configurações de compensação que eliminam a sobreposição de fluorocromo entre manchas distintas.
3. Use a amostra de embrião não injetado para estabelecer configurações que acomodem células transplantadas e de peixe-zebra.
4. Aumente a taxa de fluxo para 8000 eventos por segundo e registre 1 milhão de eventos para cada amostra.
5. Analise os dados resultantes usando o software de análise apropriado, primeiro selecionando singlets plotando FSC-H v/s FSC-A (altura v/s área), seguido por um gráfico para selecionar células viáveis. O software FlowJo é amplamente utilizado para essa análise.
6. Usando o controle de células tumorais, desenhe uma porta ao redor das células transplantadas por FSC-A v / s SSC-A e, em seguida, use as colorações indicadoras, neste caso, CD45 e mCherry (Figura 5B).
   NOTA: O portão de tamanho selecionado para o tumor também conterá células de peixe-zebra, o que fornece a base para a normalização e determinação da carga da doença.
7. Analise as amostras de embriões usando as mesmas configurações de porta acima. O gráfico final da coloração tumoral e do indicador de proteína fluorescente fornecerá uma medida da carga da doença (Figura 5C).
   NOTA: Aqui, a diferença na carga da doença foi plotada para embriões que receberam um bom bolo de células injetadas versus aqueles que receberam um bolo inferior.
8. Se necessário, classifique as células tumorais nos embriões por citometria de fluxo para análise molecular a jusante.

Resultados

Xenotransplante
Uma visão abrangente de todo o experimento e análise é representada na Figura 1, abrangendo desde a produção de embriões até a avaliação da progressão da doença por análise de sobrevivência e carga de doença por citometria de fluxo. Essa abordagem traz várias melhorias que aumentam a reprodutibilidade e escalabilidade do xenotransplante, além de adicionar uma nova maneira de avaliar a carga da doença. O sucesso desses experimentos é altam...

Discussão

O xenotransplante de peixe-zebra surgiu como uma alternativa rápida, robusta e econômica aos estudos com camundongos¹². Embora várias abordagens para o xenotransplante de peixe-zebra tenham sido relatadas, nossa adaptação resultou em melhorias significativas. Além de padronizar os parâmetros em torno do procedimento, essas melhorias se concentram especificamente em acelerar a taxa na qual as injeções de tumor podem ser realizadas, permitindo assim um aumento no número de animais por bra?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763