Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

Resumen

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Resumen

Los estudios in vivo del comportamiento tumoral son un elemento básico de la investigación del cáncer; Sin embargo, el uso de ratones presenta desafíos significativos en costo y tiempo. Aquí, presentamos larvas de pez cebra como un modelo de trasplante que tiene numerosas ventajas sobre los modelos murinos, incluida la facilidad de manejo, el bajo costo y la corta duración experimental. Además, la ausencia de un sistema inmune adaptativo durante las etapas larvales obvia la necesidad de generar y utilizar cepas inmunodeficientes. Si bien existen protocolos establecidos para el xenotrasplante en embriones de pez cebra, presentamos aquí un método mejorado que involucra la estadificación del embrión para una transferencia más rápida, el análisis de supervivencia y el uso de la citometría de flujo para evaluar la carga de la enfermedad. Los embriones se organizan en etapas para facilitar la inyección rápida de células en la yema de las larvas y el marcado celular para controlar la consistencia del bolo celular inyectado. Después de la inyección, se evalúa el análisis de supervivencia embrionaria hasta 7 días después de la inyección (ppp). Por último, también se evalúa la carga de enfermedad marcando las células transferidas con una proteína fluorescente y analizándolas mediante citometría de flujo. La citometría de flujo es posible gracias a un método estandarizado de preparación de suspensiones celulares de embriones de pez cebra, que también podría usarse para establecer el cultivo primario de células de pez cebra. En resumen, el procedimiento descrito aquí permite una evaluación más rápida del comportamiento de las células tumorales in vivo con un mayor número de animales por brazo de estudio y de una manera más rentable.

Introducción

El análisis del comportamiento de los tumores en respuesta a una alteración genética o al tratamiento farmacológico in vivo es un elemento esencial de la investigación del cáncer 1,2,3,4. En la mayoría de los casos, estos estudios implican el uso de modelos de ratón inmunocomprometidos (Mus musculus)⁵; Sin embargo, los estudios de xenotrasplantes en ratones son limitados en muchos aspectos, incluyendo la capacidad limitada, la duración prolongada, el gasto significativo y la necesidad de equipos de i....

Protocolo

El mantenimiento, la alimentación y la cría del pez cebra se realizaron en condiciones acuícolas estándar a 28,5 °C, como se describe³¹. Todos los experimentos relacionados con el pez cebra se realizaron a esta temperatura; sin embargo, después del xenotrasplante, los animales se cultivaron a 34 °C durante la duración del experimento, de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. Cría (3 días antes de la inyección)

1. Proporcionar alimento seco (alimento adicional; 5-6 gránulos por pez) a las parejas de peces una semana antes d....

Discusión

El xenotrasplante de pez cebra ha surgido como una alternativa rápida, robusta y rentable a los estudios con ratones¹². Aunque se han descrito varios enfoques para el xenotrasplante de pez cebra, nuestra adaptación ha dado lugar a mejoras significativas. Además de estandarizar los parámetros en torno al procedimiento, estas mejoras se centran específicamente en acelerar la velocidad a la que se pueden realizar las inyecciones tumorales, lo que permite un aumento en el número de animales por .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629
70 micron cell strainer	Corning	CLS431751-50EA
90 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	S43565
Agarose	Apex bioresearch	20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
calibration capillaries	Sigma	P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye	Invitrogen	C7001
Collageanse IV	Gibco	17104019
Dumont forceps number 55	Fine science tools	11255-20
FBS	Corning	35-015-CV
Fluorescence microscope	Nikon	model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate)	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean Sea Salt	Instant ocean	SS15-10
Light microscope	Nikon	model SMZ1000
Methylene blue	Sigma	M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells)	eppendorf	930001007
P1000 micropipette puller	Sutter instruments	model P-97
PM 1000 cell microinjector	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)	Sigma	E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)	Zeigler	388763