استراتيجية Gavage لصيغة ديكوتيون من الطب الصيني التقليدي في الفئران نموذج ساركوما العظمية

Summary

يوفر البروتوكول عملية توحيد مفصلة لصيغة ديكوتيون وتقنية التزويج مع مغلي Yiqi Jiedu في نموذج فأر الساركوما العظمية كمثال. يصف حماية ويحسن موثوقية البيانات البحثية ، ويوفر استراتيجيات فعالة للتحقيق في الفعالية العلاجية والآليات الجزيئية لصيغ ديكوتيون في الجسم الحي.

Abstract

صيغة ديكوتيون هي شكل الجرعة الأكثر استخداما في الطب الصيني التقليدي ويتم تطبيقها في الممارسة السريرية لآلاف السنين عن طريق الإدارة عبر الفم ، والتي تتميز بالتأثير السريع والامتصاص السهل والعلاج الفردي بناء على متلازمات محددة للمرضى. جودة صيغة ديكوتيون مسؤولة بشكل مباشر عن الفعالية السريرية للطب الصيني التقليدي. لذلك ، فإن عملية توحيد صيغة ديكوتيون مهمة لتجنب الاختلافات في جودة ديكوتيون الناجمة عن عوامل ذاتية. وفي الوقت نفسه ، نظرا لقيود إجراء التجارب السريرية ، غالبا ما تستخدم الصغيرة التي تحمل أمراضا بشرية ، مثل الفئران ، في الأبحاث الطبية لاستكشاف الفعالية العلاجية والآليات الشاملة للتدخلات المختلفة ، بما في ذلك صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي. وبالتالي ، كطريقة مهمة للإعطاء عبر الفم ، فإن تقنية التزويج الماهرة مهمة بشكل خاص لتجنب تلف المريء المحتمل وانسكاب الدواء ، مما يضمن إعطاء كمية متساوية من الدواء لكل نموذجي ، مما يؤدي إلى نتائج تجريبية دقيقة. علاوة على ذلك ، فإن الطريقة الموحدة لإعداد صيغة ديكوتيون واستراتيجية التزويج الماهرة ضرورية لحماية رعاية وتقليل عدد المستخدمة. هنا ، أبلغنا عن عملية توحيد مفصلة لصيغة ديكوتيون وتقنية التزجيج باستخدام Yiqi Jiedu decoction في نموذج فأر الساركوما العظمية كمثال. تم تقييم الفعالية من خلال حجم الورم. سيعمل هذا البروتوكول على زيادة حماية إلى أقصى حد وتحسين موثوقية بيانات البحث ، وبالتالي توفير استراتيجيات فعالة للتحقيق في الفعالية العلاجية المستقبلية والآليات الجزيئية لصيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي في الجسم الحي.

Introduction

صيغة ديكوتيون هي شكل الجرعة الأكثر استخداما للطب الصيني التقليدي والأدوية الطبية السائلة^1،2. تتم معالجة صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي عن طريق إزالة الأعشاب في الماء بعد نقعها ، تليها التصفية للتخلص من الثمالة.

نظرا لأنه يمكن تخصيص تركيبة ديكوتيون بناء على الضرورات السريرية ، خاصة بما يتماشى مع خصائص العلاج القائم على الأدلة في الطب الصيني التقليدي ، فقد تم تطبيق شكل الجرعة هذا عن طريق الإعطاء عن طريق الفم في الممارسة السريرية لآلاف السنين مع مزايا محددة لا يمكن الاستغناء عنها ^3,4. ترتبط جودة صيغة ديكوتيون ارتباطا مباشرا بالفعالية السريرية. لذلك ، يجب تحضير تركيبة ديكوتيون بناء على مبادئ طرق ديكوتيون الموحدة لضمان استخراج المكونات النشطة وحمايتها إلى أقصى^{حد 3}. وفي الوقت نفسه ، الأدوية الجاهزة ديكوتيون هي الشكل الرئيسي للأعشاب الصينية الخام المستخدمة في الممارسة السريرية. يجب أن تتوافق معايير الجودة وطرق إنتاج الأدوية الموصوفة الجاهزة ديكوتيون مع أحكام دستور الأدوية الصيني². علاوة على ذلك ، يجب نقع الأدوية الموصوفة الجاهزة ديكوتيون في ماء الشرب البارد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تفكيكها في وعاء صيدلاني خاص عن طريق تسخين⁵. أظهرت الدراسات أنه يمكن استخراج معظم المكونات النشطة عن طريق الفك لمرتين ، كما تنص مدونة الممارسات لإدارة غرف ديكوتيون للأدوية الصينية التقليدية في المؤسسات الطبية على أن يتم ديكوتيون مرتين^4،6،7. إذا تم وصف الأعشاب الصينية الخاصة ، مثل تلك ذات الملمس الصلب أو المقويات ، فمن المستحسن تمديد وقت ديكوتيون. يجب أن تكون أواني ديكوتيون وحاويات التخزين التي تتلامس مباشرة مع تركيبة ديكوتيون ، بدءا من الحاوية التي تنقع فيها الأدوية الموصوفة الجاهزة ، مستقرة كيميائيا ولها أغطية ، مثل الأوعية المقاومة للحرارة والسيراميك والزجاج والفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك ، لا ينبغي استخدام الألمنيوم والمنتجات البلاستيكية العادية ، في حين يجب حظر الحديد والأواني المسببة للتآكل الأخرى لتجنب التفاعلات الكيميائية المحتملة ، مما يقلل من الفعالية العلاجية وحتى ينتج عنه آثار ضارة^4،6،7.

نظرا لقيود إجراء التجارب السريرية ، غالبا ما تستخدم الصغيرة التي تحمل الأمراض البشرية ، مثل الفئران ، في الأبحاث الطبية لاستكشاف الفعالية العلاجية والآليات الشاملة للتدخلات المختلفة بما في ذلك صيغة ديكوتيون للطب الصيني التقليدي ^8,9; ومع ذلك ، على عكس البشر ، يجب تحضير صيغ ديكوتيون كل يوم ، وخلطها معا ، وإدارتها طازجة 2x يوميا في الممارسة السريرية. غير قادرة على تناول أدويتها طواعية في الوقت المحدد بالجرعة المطلوبة ، ومعظم التجارب على المتعلقة بالطب الصيني التقليدي هي إعطاء عن طريق الفم قائم على التزويج لصيغ ديكوتيون في الوقت الحاضر. يجب تحضير تركيبات ديكوتيون المستخدمة في التجارب على في الجسم الحي مسبقا ، وتخزينها في -20 درجة مئوية وإذابتها قبل الاستخدام مباشرة^3،4،10. علاوة على ذلك ، فإن تجميد دون المستوى المطلوب والتلاعب بإبرة التزويج يزيد من خطر الإصابات غير الضرورية والعواطف السلبية. لذلك ، كطريقة مهمة لتوصيل الأدوية عبر الفم ، فإن تقنية التزويج الماهرة مهمة بشكل خاص لتجنب إصابة المريء المحتملة وانسكاب الدواء ، وبالتالي ضمان حصول كل نموذجي على كمية متساوية من الأدوية العشبية الموصوفة لتحقيق نتائج تجريبية دقيقة. هنا ، نحن نقدم بروتوكول gavage لصيغة ديكوتيون من الطب الصيني التقليدي.

Protocol

يصف هذا البروتوكول تقنية التزويج التفصيلية في الفئران النموذجية للساركوما العظمية باستخدام ديكوتيون Yiqi Jiedu كعينة. تم استخدام ذكور الفئران الأثيمية البالغة من العمر أربعة أسابيع (BALB / c nude) في هذه التجربة وتم الاحتفاظ بها في غرفة تربية SPF في مركز المختبر في جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل إدارة ولجنة جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي ، وامتثلت لمدونة أخلاقيات المختبر (رقم الموافقة على أخلاقيات: PZSHUTCM2304060007) ، وأجريت بما يتفق بدقة مع المتطلبات الدولية المتعلقة بحيوانات المختبر.

1. المواد

1. احصل على المواد التالية: الأعشاب الصينية (الجينسنغ 42 جم ، Hedyotis diffusa 52.5 جم ، عشب القلنسوة الشائكة 31.5 جم) ، حقنة 1 مل ، وإبرة تجويف الكوع 12 جم / 55 مم (الشكل 1).

2. تحديد الجرعة

1. احسب الجرعة اليومية على النحو التالي: الجرعة اليومية للبالغين الذين يبلغ وزنهم القياسي 60 كجم هي الجينسنغ 12 جم ، Hedyotis diffusa 15 جم ، وعشب قلنسوة الشائكة 9 جم ، بإجمالي 36 جم دواء جاهز ديكوتيون ، أي 0.6 جم من الأدوية الجاهزة ديكوتيون / كجم من وزن الجسم. بالإشارة إلى 12 مرة للجرعة المكافئة ، و 6 مرات للجرعة المنخفضة ، و 24 مرة للجرعة العالية بين البالغين الذين يبلغ وزن الجسم القياسي 60 كجم والفئران ذات وزن الجسم القياسي 25 جم وفقا لمساحة سطح الجسم¹¹ ، بالإضافة إلى بياناتنا الأولية ، استخدم نسبة جرعة 20 مرة من Yiqi Jiedu decoction للفئران في الدراسة الحالية ، لذلك ، كانت جرعة الفئران 12 جم من الأدوية الجاهزة ديكوتيون / كجم من وزن الجسم.
2. احسب الجرعة لكل ماوس باستخدام المعادلة:
   جرعة الفأر (وزن جسم الحامل) = جرعة للبالغين (وزن جسم الحامل) × 20 (نسبة الجرعة المكافئة المحددة).
   الجرعة اليومية لكل فأر هي 0.3 جم [(12 جم أدوية جاهزة ديكوتيون / 1000 جم من وزن الجسم) × 25 جم من وزن الجسم] في 200 ميكرولتر بتركيز نهائي قدره 1.5 جم / مل.
3. احسب إجمالي الأدوية الجاهزة للديكوتيون للفئران (ن = 7) في مجموعة Yiqi Jiedu decoction مع إعطاء gavage لمدة 28 يوما ليكون 58.8 جم. ركز هذا إلى 39.2 mL للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1.5 g/mL.
4. النظر في فقدان المخدرات المحتملة خلال مراحل ديكوتيون و gavage ، ولتسهيل الحساب ، وإعداد ما مجموعه 126 غرام (الجينسنغ 42 غرام ، Hedyotis diffusa 52.5 غرام ، عشب قلنسوة الشائكة 31.5 غرام) دواء جاهز ديكوتيون ، والتركيز في حجم نهائي من 84 مل.

3. مصدر الخلية والثقافة

1. قم بشراء خلايا الساركوما العظمية 143B المشتقة من الإنسان من بنك خلايا ATCC.
2. بذرة 1 × 10⁶ 143 خلية B في 10 مل من وسط MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في طبق زراعة الخلايا 10 سم.
3. زراعة خلايا 143B عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪ حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80٪ -90٪.

4. طرق النمذجة

1. اجمع 80٪ من خلايا 143B المستنبتة المتقاربة ، وأعد تعليقها في 6 مل من وسط MEM المحتوي على 10٪ مصل واخلطها مع هلام مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة حجم 1: 1 لعمل تعليق خلية بتركيز نهائي 1 × 10⁷ خلايا / مل.
2. حقن 10 ميكرولتر من معلق الخلية في الساق اليسرى لكل فأر أثيمي لإنشاء نموذج فأر ساركوما عظمية في الموقع ، كما هو موضح في منشورنا السابق¹². الخطوات باختصار هي كما يلي.
   1. اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني. التربسين الخلايا مع 1.5 مل من 0.25 ٪ التربسين لمدة 3 دقائق. أضف 6 مل من وسائط MEM المحتوية على 10٪ مصل. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
   2. نضح 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في غرفة لوحة عد الخلايا وحساب تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية التلقائي. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 800 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة غشاء القاعدية 8.5 مجم / مل ، وضعها على الثلج.
   4. تخدير الفئران عن طريق تعريضها ل 2٪ إيزوفلوران و 98٪ أكسجين (معدل تدفق الأكسجين ، 2 لتر / دقيقة). ضع كمية صغيرة من مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
   5. نفذ الإجراء بأكمله في منطقة جيدة التهوية. قبل حقن خلايا الساركوما العظمية ، تأكد من أن كل فأر يخضع للتخدير العميق عن طريق لمس القدم برفق ؛ إذا كان الماوس لا يزال لديه استجابات ، مثل نشل أو رعشة. انتظر لفترة أطول إذا كان الماوس لا يزال لديه استجابات ، مثل نشل أو رعشة ، حتى تختفي هذه الاستجابات.
   6. ضع الماوس في وضع ضعيف. امسك كاحل الماوس باستخدام الإبهام والسبابة وقم بتطهير موقع حقن الساق بثلاث جولات متناوبة من البيتادين و 70٪ من الإيثانول.
   7. قم بتوصيل الإبرة بمحقنة سعة 1 مل ووجه طرف الإبرة نحو موقع الحقن الموازي لمحور الظنبوب. أدخل الإبرة عن طريق الجلد لحفر ثقب عبر منصة الساق باتجاه الطرف البعيد من الساق.
   8. قم بتحميل معلق خلايا الساركوما العظمية الذي تم وضعه مسبقا على الثلج في حقنة ميكروحجمية واستبدل المحقنة سعة 1 مل في الساق بحقنة ميكروحجمية محملة بخلايا الساركوما العظمية. حقن ببطء ما يقرب من 10 ميكرولتر من (1 × 10⁷ خلايا / مل) معلق خلايا الساركوما العظمية في قصبة كل فأر أثيمي.
   9. قم بإزالة المحقنة ذات الحجم الصغير من موقع الحقن ، واضغط على موقع الحقن بقطعة القطن لمدة 30 ثانية تقريبا. ضع الماوس مرة أخرى في قفص نظيف ولاحظ تعافيه لمدة 10 دقائق.

5. إعداد صيغة مغلي الطب الصيني التقليدي للتزجيج (الشكل 2)

1. احسب الجرعة حسب الخطوة 2.
2. نقع جميع الأعشاب الطبية لديكوتيون ، باستثناء عشب الجينسنغ باهظة الثمن ، في مياه الشرب مع مستوى 3 سم أعلى من سطح الدواء ، لمدة 30 دقيقة ، ثم أداء ديكوتيون 2x كما هو موضح أدناه.
3. قم بإجراء ديكوتيون الأول عن طريق التسخين حتى الغليان على نار قوية ، ثم التسخين لمدة 15-25 دقيقة على نار خفيفة. يشير الحريق المعتدل إلى حرارة منخفضة الطاقة تتراوح درجات الحرارة عادة من 80 درجة مئوية إلى 100 درجة مئوية ، بينما يشير الحريق القوي إلى حرارة عالية الطاقة تتراوح عادة من 200 درجة مئوية إلى 300 درجة مئوية.
4. صب السائل ديكوتيون في حاوية واحدة.
5. قم بإجراء ديكوتيون الثاني عن طريق تسخين الأعشاب الطبية في مياه الشرب ، بحجم يكفي فقط لغمر سطح الدواء ، ليغلي على نار قوية ، ثم يسخن لمدة 15-25 دقيقة على نار خفيفة.
6. صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4.
7. نقع و decoct 42 غرام من الجينسنغ بشكل منفصل ، مع مياه الشرب 3 سم أعلى من سطح الدواء ، لأنه مكلف.
8. أداء ديكوتيون الأول من الجينسنغ غارقة عن طريق تسخينه على نار قوية لمدة 60 دقيقة.
   صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4.
9. أداء ديكوتيون الثاني من الجينسنغ في مياه الشرب مع حجم يكفي فقط لغمر سطح الدواء ، عن طريق التدفئة على نار خفيفة لمدة 40 دقيقة. صب السائل ديكوتيون في نفس الحاوية كما في الخطوة 5.4.
   ملاحظة: يجب أن تكون الحاويات المستخدمة في ديكوتيون مستقرة كيميائيا ، مثل الأوعية المقاومة للحرارة (الأكثر استخداما في الممارسة السريرية) والسيراميك والزجاج والفولاذ المقاوم للصدأ لتجنب التفاعلات الكيميائية المحتملة مع المواد الطبية. يجب وضع كل سائل ديكوتيون تم الحصول عليه من خطوات مختلفة في نفس الحاوية.
10. امزج وفلتر سائل ديكوتيون باستخدام ثلاث طبقات من الشاش مثبتة عند فم كوب قياس بأشرطة مطاطية.
11. اغلي المرتقي المصفى على نار قوية في وعاء ، ثم قم بتغييره إلى نار خفيفة واحتفظ بالنار الخفيفة حتى الوصول إلى التركيز المستهدف (حجم نهائي 84 مل بتركيز نهائي 1.5 جم / مل).
12. تحضير 21 مل من ديكوتيون مركزة وفقا للجرعة المطلوبة للإعطاء داخل المعدة لمدة 1 أسبوع ، وتخزين القسمة في الثلاجة في -20 درجة مئوية.

6. إدارة Gavage في الفئران باستخدام جهاز gavage

1. ضع الماوس على سطح قفص الماوس أو أي سطح آخر أكثر خشونة.
2. أمسك ذيل الماوس بالإبهام والسبابة من اليد اليمنى. ثم أمسك عنق الماوس بالإبهام والسبابة والإصبع الأوسط من اليد اليسرى.
3. امسك ذيل الفأر بالإصبعين الآخرين من اليد اليسرى لجعل رأس الفأر ورقبته وجسمه في خط مستقيم.
   ملاحظة: تأكد من إبقاء الماوس مسترخيا أثناء عملية الإمساك بأكملها. إذا استمر الماوس في النضال من أجل الحركة ، فيجب إجراء عملية الإمساك حتى يتم استرخاء الماوس.
4. امسك جهاز التزويج في اليد اليمنى وقم بتحميل 200 ميكرولتر من تركيبة ديكوتيون للماوس مع 20 جم من وزن الجسم (100 ميكرولتر من تركيبة ديكوتيون / 10 جم من وزن الجسم من الماوس).
5. أدخل إبرة التجويف في الفم من الزاوية وادفع اللسان ضد الفك العلوي للماوس.
6. حافظ على جسم الفأر في نفس الاتجاه وادفع إبرة التجويف برفق نحو المعدة على طول المريء حتى يتم ترك حوالي 10 مم من إبرة التجويف بالخارج.
   ملاحظة: هناك شعور أجوف عندما تدخل إبرة التجويف إلى المريء. يجب قياس طول إبرة التجويف التي يتم إدخالها في الماوس إلى أعلى القص. يبلغ الطول الإجمالي لإبرة التجويف 60 مم (الشكل 3) ، لذلك يجب إدخال حوالي 50 مم من إبرة التجويف في جسم الفأر قبل حقن تركيبة ديكوتيون في معدة الفأر.
7. حقن صيغة ديكوتيون في المعدة من الماوس. إن مواجهة المقاومة أو السائل الخارج من زاوية الفم يعني وضع إبرة التجويف في غير مكانها ، والتي يجب تجنبها. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إبطاء سرعة الحقن إذا كانت تركيبة ديكوتيون سميكة.
8. حرر الماوس وراقبه لمدة 10 دقائق. ينجح التجويف إذا لم يلاحظ أي خلل في التنفس وإعادة الماوس إلى القفص (الشكل 4).

7. مسار العلاج

1. لاستكشاف الفعالية العلاجية ل Yiqi Jiedu decoction ، قم بإعداد مجموعة تحكم ومجموعة Yiqi Jiedu decoction. بالنسبة للفئران في المجموعة الضابطة ، يتم تطبيق محلول ملحي فسيولوجي ، مرة واحدة يوميا لمدة 28 يوما. بالنسبة للفئران في مجموعة Yiqi Jiedu decoction ، قم بإدارة Yiqi Jiedu ديكوتيون مرة واحدة يوميا لمدة 28 يوما.

8. ردود الفعل السلبية

1. راقب عن كثب حالة الفئران بعد وضعها مرة أخرى في القفص ، بما في ذلك فقدان الوزن وانخفاض الحالة العقلية بسبب عدم قدرة الطعام على الدخول إلى المعدة.
2. ستواجه الفئران صعوبة في التنفس وضيق في التنفس بسبب انسداد القصبة الهوائية الناجم عن الطعام وسوف تسعل في محاولة لإزالة القصبة الهوائية. إذا لوحظ أي من هذه الأعراض أثناء التزويج ، فقم بإيقاف التجويف على الفور والقتل الرحيم للفئران.

النتائج

تم تحديد التأثير المثبط ل Yiqi Jiedu decoction على نمو الساركوما العظمية في الجسم الحي في نموذج فأر الساركوما العظمية داخل الظنبوب ، والذي تم تحضيره عن طريق حقن خلايا الساركوما العظمية 143B في قصبة الفئران الذئيمية. تم إعطاء ديكوتيون Yiqi Jiedu للفئران من مجموعة Yiqi Jiedu decoction عن طريق التزويج لمدة 28 يوم...

Discussion

ترتبط الفعالية السريرية للأعشاب الموصوفة في الطب الصيني التقليدي إلى حد كبير بالجرعة المعطاة وشكل الجرعة. لذلك ، فإن إنشاء استراتيجية ديكوتيون موحدة وعملية إدارة ماهرة ضرورية في الممارسة السريرية ، وكذلك في تحسين موثوقية النتائج التجريبية.

في هذه الدراسة ، قدمنا أولا است?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells