Stratégie de gavage pour la formule de décoction de la médecine traditionnelle chinoise chez les souris modèles d’ostéosarcome

Résumé

Le protocole fournit un processus de standardisation détaillé de la formule de décoction et de la technique de gavage avec la décoction de Yiqi Jiedu dans le modèle murin d’ostéosarcome comme exemple. Il décrit la protection des animaux et améliore la fiabilité des données de recherche, fournissant des stratégies efficaces pour étudier l’efficacité thérapeutique et les mécanismes moléculaires des formules de décoction in vivo.

Résumé

La formule de décoction est la forme posologique la plus couramment utilisée en médecine traditionnelle chinoise et appliquée dans la pratique clinique depuis des milliers d’années par administration trans-orale, qui se caractérise par un effet rapide, une absorption facile et un traitement individualisé basé sur les syndromes spécifiques des patients. La qualité de la formule de décoction est directement responsable de l’efficacité clinique de la médecine traditionnelle chinoise ; Par conséquent, le processus de normalisation de la formule de décoction est important pour éviter les différences de qualité de décoction causées par des facteurs subjectifs. Pendant ce temps, en raison des limites de la réalisation d’expériences cliniques, les petits animaux porteurs de maladies humaines, tels que les souris, sont souvent utilisés dans la recherche médicale pour explorer l’efficacité thérapeutique et les mécanismes complets de différentes interventions, y compris la formule de décoction pour la médecine traditionnelle chinoise. Par conséquent, en tant que méthode d’administration trans-orale importante, la technique de gavage qualifié est particulièrement importante pour éviter les dommages potentiels à l’œsophage et le déversement de médicaments, ce qui garantira une quantité égale de médicament administrée à chaque animal modèle, conduisant à des résultats expérimentaux précis. De plus, la méthode standardisée de préparation de la formule de décoction et la stratégie de gavage qualifiée sont nécessaires pour protéger le bien-être des animaux et minimiser le nombre d’animaux utilisés. Ici, nous avons rapporté un processus de standardisation détaillé de la formule de décoction et de la technique de gavage avec la décoction de Yiqi Jiedu dans un modèle murin d’ostéosarcome comme exemple. L’efficacité a été évaluée par le volume tumoral. Ce protocole maximisera la protection des animaux et améliorera la fiabilité des données de recherche, fournissant ainsi des stratégies efficaces pour l’étude future de l’efficacité thérapeutique et des mécanismes moléculaires de la formule de décoction pour la médecine traditionnelle chinoise in vivo.

Introduction

La formule de décoction est la forme posologique la plus couramment utilisée de la médecine traditionnelle chinoise et des médicaments liquides ^1,2. La formule de décoction de la médecine traditionnelle chinoise est traitée en décoctant les herbes dans de l’eau après avoir été trempées, puis filtrées pour éliminer la lie.

Parce que la formule de décoction peut être individualisée en fonction des besoins cliniques, en particulier en fonction des caractéristiques du traitement fondé sur des preuves dans la médecine traditionnelle chinoise, cette forme posologique par administration trans-orale est appliquée dans la pratique clinique depuis des milliers d’années avec des avantages spécifiques et irremplaçables ^3,4. La qualité de la formule de décoction est directement liée à l’efficacité clinique. Par conséquent, la formule de décoction doit être préparée selon les principes des méthodes de décoction standardisées afin de garantir que les ingrédients actifs sont extraits et protégés au maximum³. Pendant ce temps, les médicaments prêts à la décoction sont la principale forme d’herbes chinoises brutes utilisées dans la pratique clinique ; les normes de qualité et les méthodes de production des médicaments prescrits prêts à la décoction doivent être conformes aux dispositions de la pharmacopée chinoise². De plus, les médicaments prescrits prêts à la décoction doivent être trempés dans de l’eau potable froide pendant au moins 30 minutes avant d’être décoctés dans un pot pharmaceutique spécial en chauffant⁵. Des études ont montré que la plupart des ingrédients actifs peuvent être extraits par décoction deux fois, et le Code de pratique pour l’administration des salles de décoction des médecines traditionnelles chinoises dans les établissements médicaux prescrit également que la décoction doit être faite deux fois ^4,6,7. Si des herbes chinoises spéciales, telles que celles à texture dure ou toniques, sont prescrites, il est recommandé de prolonger le temps de décoction. Les ustensiles de décoction et les récipients de stockage qui entrent directement en contact avec la formule de décoction, à partir du récipient dans lequel les médicaments prescrits prêts à décocter sont trempés, doivent être chimiquement stables et avoir des couvercles, tels que des casseroles, de la céramique, du verre et de l’acier inoxydable. Cependant, les produits en aluminium et en plastique ordinaire ne doivent pas être utilisés, tandis que le fer et autres ustensiles corrosifs doivent être interdits pour éviter d’éventuelles réactions chimiques, qui réduiront l’efficacité thérapeutique et même produiront des effets nocifs ^4,6,7.

En raison des limites de la réalisation d’expériences cliniques, les petits animaux porteurs de maladies humaines, tels que les souris, sont souvent utilisés dans la recherche médicale pour explorer l’efficacité thérapeutique et les mécanismes complets de différentes interventions, y compris la formule de décoction de la médecine traditionnelle chinoise ^8,9 ; Cependant, contrairement aux humains, les formules de décoction doivent être préparées tous les jours, mélangées et fraîchement administrées 2 fois par jour en pratique clinique. Les animaux ne sont pas en mesure de prendre volontairement leurs médicaments à temps avec la dose requise, et la plupart des expériences animales liées à la médecine traditionnelle chinoise sont actuellement l’administration orale par gavage des formules de décoction. Les formules de décoction utilisées pour les expériences in vivo sur les animaux doivent être préparées à l’avance, aliquotes, stockées à -20 °C et décongelées juste avant utilisation ^3,4,10. De plus, l’immobilisation des animaux et la manipulation des aiguilles par gavage augmentent le risque de blessures inutiles et d’émotions négatives. Par conséquent, en tant que méthode importante d’administration transorale de médicaments, la technique de gavage qualifié est particulièrement importante pour éviter d’éventuelles lésions œsophagiennes et un déversement de médicament, garantissant ainsi que chaque animal modèle reçoit une quantité égale de médicaments à base de plantes prescrits pour obtenir des résultats expérimentaux précis. Ici, nous fournissons un protocole de gavage pour la formule de décoction de la médecine traditionnelle chinoise.

Protocole

Ce protocole décrit la technique détaillée du gavage chez des souris modèles d’ostéosarcome en utilisant la décoction Yiqi Jiedu comme échantillon. Des souris athymiques mâles âgées de quatre semaines (BALB/c nude) ont été utilisées dans cette expérience et gardées dans la salle d’élevage de qualité SPF du Laboratory Animal Center de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par la gestion des animaux et le comité de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai, conformes au Code d’éthique pour les animaux de laboratoire (numéro d’approbation de l’éthique animale : PZSHUTCM2304060007) et menées en stricte conformité avec les exigences internationales relatives aux animaux de laboratoire.

1. Matériaux

1. Procurez-vous les matières suivantes : herbes chinoises (ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, scutellaire barbelée 31,5 g), seringue de 1 mL et aiguille de gavage coudée de 12 g/55 mm (figure 1).

2. Détermination du dosage

1. Calculez la dose quotidienne comme suit : la dose quotidienne pour les adultes d’un poids corporel standard de 60 kg est de 12 g pour le ginseng, de 15 g pour Hedyotis diffusa et de 9 g pour la scutellaire barbelée, avec un total de 36 g de médicaments prêts à la décoction, soit 0,6 g de médicaments prêts à la décoction/kg de poids corporel. En se référant aux 12 fois pour la dose équivalente, 6 fois pour la faible dose et 24 fois pour la dose élevée entre les adultes ayant un poids corporel standard de 60 kg et les souris ayant un poids corporel standard de 25 g selon la surface corporelle¹¹, ainsi qu’à nos données préliminaires, utiliser un rapport de dose de 20 fois la décoction de Yiqi Jiedu pour les souris de la présente étude, Par conséquent, la posologie pour les souris était de 12 g de médicaments prêts à décoction/kg de poids corporel.
2. Calculez la posologie pour chaque souris en utilisant l’équation :
   Posologie pour la souris (poids corporel de la support) = dose pour l’adulte (poids corporel de la support) x 20 (rapport de dose équivalent désigné).
   La dose quotidienne de chaque souris est de 0,3 g [(12 g de médicaments prêts à décoction/1000 g de poids corporel) x 25 g de poids corporel] dans 200 μL avec une concentration finale de 1,5 g/mL.
3. Calculer la quantité totale de médicaments prêts à la décoction pour les souris (n = 7) dans le groupe de décoction Yiqi Jiedu avec administration par gavage pendant 28 jours à 58,8 g. Concentrez-le à 39,2 mL pour atteindre une concentration finale de 1,5 g/mL.
4. Compte tenu de la perte possible de médicament pendant les étapes de décoction et de gavage, et pour faciliter le calcul, préparer un total de 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Spilotte barbelée 31,5 g) de médicament prêt à la décoction, concentrer dans un volume final de 84 mL.

3. Source et culture cellulaires

1. Achetez des cellules d’ostéosarcome 143B d’origine humaine auprès de la banque de cellules ATCC.
2. Semez 1 x 10⁶ cellules 143B dans 10 mL de milieu MEM contenant 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm.
3. Cultiver 143 cellules B à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % ou 90 %.

4. Méthodes de modélisation

1. Prélever les cellules 143B confluentes cultivées à 80 %, les remettre en suspension dans 6 mL de milieu MEM contenant 10 % de sérum et les mélanger avec un gel matriciel de la membrane basale dans un rapport volumique de 1:1 pour obtenir une suspension cellulaire avec une concentration finale de 1 x 10⁷ cellules/mL.
2. Injecter 10 μL de suspension cellulaire dans le tibia gauche de chaque souris athymique pour établir un modèle murin d’ostéosarcome xénogreffé in situ , tel que décrit dans notre précédente publication¹². Les étapes en bref sont les suivantes.
   1. Lavez les cellules 2x avec du PBS. Trypsiniser les cellules avec 1,5 mL de trypsine à 0,25 % pendant 3 min. Ajouter 6 ml de milieu MEM contenant 10 % de sérum. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.
   2. Aspirer 20 μL de suspension cellulaire dans la chambre de la plaque de comptage cellulaire et calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur automatique de cellules. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une matrice de membrane basale à 8,5 mg/mL et les placer sur de la glace.
   4. Anesthésier les souris en les exposant à 2 % d’isoflurane et à 98 % d’oxygène (débit d’oxygène, 2 L/min). Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie.
   5. Effectuez toute la procédure dans un endroit bien ventilé. Avant l’injection de cellules d’ostéosarcome, assurez-vous que chaque souris est sous anesthésie profonde en touchant doucement le pied ; si la souris a encore des réponses, telles que des contractions ou des secousses. Attendez plus longtemps si la souris a encore des réponses, telles que des contractions ou des secousses, jusqu’à ce que ces réponses disparaissent.
   6. Placez la souris en position couchée. Tenez la cheville de la souris à l’aide du pouce et de l’index et désinfectez le site d’injection du tibia avec trois cycles alternés de bétadine et d’écouvillon d’éthanol à 70 %.
   7. Fixez l’aiguille à une seringue de 1 mL et pointez l’extrémité de l’aiguille vers le site d’injection parallèlement à l’axe du tibia. Insérez l’aiguille par voie percutanée pour percer un trou à travers la plate-forme tibiale vers l’extrémité distale du tibia.
   8. Charger la suspension de cellules d’ostéosarcome précédemment placée sur de la glace dans une seringue à microvolume et remplacer la seringue de 1 mL dans le tibia par la seringue à microvolume chargée de cellules d’ostéosarcome. Injecter lentement environ 10 μL de suspension de cellules d’ostéosarcome (1 x 10⁷ cellules/ml) dans le tibia de chaque souris athymique.
   9. Retirez la seringue microvolume du site d’injection et appuyez sur le site d’injection avec le coton-tige pendant environ 30 s. Replacez la souris dans une cage propre et observez sa récupération pendant 10 min.

5. Préparation de la formule de décoction de médecine traditionnelle chinoise pour gavage (figure 2)

1. Calculez le dosage selon l’étape 2.
2. Faites tremper toutes les herbes médicinales pour la décoction, à l’exception de l’herbe coûteuse Ginseng, dans de l’eau potable d’un niveau de 3 cm plus haut que la surface du médicament, pendant 30 min, puis effectuez la décoction 2x comme décrit ci-dessous.
3. Effectuez la première décoction en chauffant à ébullition à feu vif, puis en chauffant pendant 15 à 25 minutes à feu doux. Un feu léger fait référence à une chaleur de faible puissance avec des températures allant généralement de 80 °C à 100 °C, tandis qu’un feu fort fait référence à une chaleur de haute puissance allant généralement de 200 °C à 300 °C.
4. Versez le liquide de décoction dans un récipient.
5. Effectuez la deuxième décoction en chauffant les herbes médicinales dans de l’eau potable, avec un volume juste assez pour immerger la surface du médicament, jusqu’à ébullition sur un feu puissant, puis en chauffant pendant 15-25 minutes à feu doux.
6. Versez le liquide de décoction dans le même récipient qu’à l’étape 5.4.
7. Faites tremper et décoctez 42 g de ginseng séparément, avec de l’eau potable 3 cm plus haut que la surface du médicament, car cela coûte cher.
8. Réalisez la première décoction de ginseng trempé en la chauffant à feu vif pendant 60 min.
   Versez le liquide de décoction dans le même récipient qu’à l’étape 5.4.
9. Effectuer la deuxième décoction de ginseng dans de l’eau potable avec un volume juste suffisant pour immerger la surface du médicament, en chauffant à feu doux pendant 40 min. Versez le liquide de décoction dans le même récipient qu’à l’étape 5.4.
   REMARQUE : Les récipients utilisés pour la décoction doivent être chimiquement stables, tels que des casseroles (les plus couramment utilisées en pratique clinique), de la céramique, du verre et de l’acier inoxydable pour éviter d’éventuelles réactions chimiques avec les substances médicinales. Tout liquide de décoction obtenu à partir de différentes étapes doit être mis dans le même récipient.
10. Mélanger et filtrer le liquide de décoction à l’aide de trois couches de gaze fixées à l’embouchure d’une tasse à mesurer avec des élastiques.
11. Faire bouillir la décoction filtrée à feu vif dans une casserole, puis passer à feu doux et maintenir le feu doux jusqu’à atteindre la concentration cible (un volume final de 84 mL avec une concentration finale de 1,5 g/mL).
12. Préparer 21 mL d’aliquotes de décoction concentrée selon la dose requise pour l’administration intragastrique pendant 1 semaine, et conserver les aliquotes au réfrigérateur à -20 °C.

6. Administration par gavage chez la souris à l’aide d’un dispositif de gavage

1. Placez la souris sur la surface de la cage de la souris ou sur une autre surface plus rugueuse.
2. Saisissez la queue de la souris avec le pouce et l’index de la main droite. Ensuite, saisissez le cou de la souris avec le pouce, l’index et le majeur de la main gauche.
3. Tenez la queue de la souris avec les deux autres doigts de la main gauche pour former la tête, le cou et le corps de la souris en ligne droite.
   REMARQUE : Assurez-vous de garder la souris détendue pendant tout le processus de préhension. Si la souris continue de lutter pour bouger, le processus de préhension doit être effectué jusqu’à ce que la souris soit détendue.
4. Tenez le dispositif de gavage dans la main droite et chargez 200 μL de formule de décoction pour une souris avec un poids corporel de 20 g (100 μL de formule de décoction/10 g de poids corporel de souris).
5. Insérez l’aiguille de gavage dans la bouche à partir du coin et poussez la langue contre la mâchoire supérieure de la souris.
6. Gardez le corps de la souris dans la même direction et poussez doucement l’aiguille de gavage vers l’estomac le long de l’œsophage jusqu’à ce qu’il reste environ 10 mm de l’aiguille de gavage à l’extérieur.
   REMARQUE : Il y a une sensation de creux lorsque l’aiguille de gavage pénètre dans l’œsophage. La longueur de l’aiguille de gavage insérée dans la souris doit être mesurée jusqu’au sommet du sternum. La longueur totale de l’aiguille de gavage est de 60 mm (figure 3), par conséquent, environ 50 mm de l’aiguille de gavage doivent être insérés dans le corps de la souris avant que la formule de décoction ne soit injectée dans l’estomac de la souris.
7. Injectez la formule de décoction dans l’estomac de la souris. Rencontrer une résistance ou un liquide sortant du coin de la bouche signifie un mauvais placement de l’aiguille de gavage, ce qui doit être évité. De plus, la vitesse d’injection doit être ralentie si la formule de décoction est épaisse.
8. Relâchez la souris et observez-la pendant 10 min. Le gavage réussit si aucune anomalie respiratoire n’est observée et ramène la souris dans la cage (Figure 4).

7. Déroulement du traitement

1. Pour explorer l’efficacité thérapeutique de la décoction Yiqi Jiedu, mettez en place un groupe témoin et un groupe de décoction Yiqi Jiedu. Pour les souris du groupe témoin, administrer une solution saline physiologique, une fois par jour pendant 28 jours. Pour les souris du groupe de décoction Yiqi Jiedu, administrer la décoction Yiqi Jiedu une fois par jour pendant 28 jours.

8. Effets indésirables

1. Observez attentivement l’état des souris après avoir été remises dans la cage, y compris la perte de poids et la diminution de l’état mental en raison de l’incapacité de la nourriture à entrer dans l’estomac.
2. Les souris éprouveront des difficultés à respirer et un essoufflement en raison d’une obstruction trachéale causée par l’alimentation et tousseront pour tenter de dégager la trachée. Si l’un de ces symptômes est observé pendant le gavage, arrêtez immédiatement le gavage et euthanasiez les souris.

Résultats

L’effet inhibiteur de la décoction de Yiqi Jiedu sur la croissance de l’ostéosarcome in vivo a été déterminé dans un modèle murin d’ostéosarcome à xénogreffe intra-tibiale, qui a été préparé en injectant les cellules d’ostéosarcome 143B dans le tibia de souris athymiques. La décoction de Yiqi Jiedu a été administrée aux souris du groupe de décoction de Yiqi Jiedu par gavage pendant 28 jours à partir du deuxième jour de l’injection de 143B. Une solution saline physiologique a été...

Discussion

L’efficacité clinique des herbes prescrites en médecine traditionnelle chinoise est largement associée à la dose administrée et à la forme posologique ; Par conséquent, l’établissement d’une stratégie de décoction standardisée et d’un processus d’administration qualifié sont nécessaires dans la pratique clinique, ainsi que pour améliorer la fiabilité des résultats expérimentaux.

Dans cette étude, nous avons d’abord fourni une stratégie détaillée pour la décoct...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells