Estrategia de sonda nasogástrica para la fórmula de decocción de la medicina tradicional china en ratones modelo de osteosarcoma

Resumen

El protocolo proporciona un proceso de estandarización detallado de la fórmula de decocción y la técnica de sonda nasogástrica con la decocción de Yiqi Jiedu en el modelo de ratón con osteosarcoma como ejemplo. Describe la protección de los animales y mejora la fiabilidad de los datos de investigación, proporcionando estrategias eficaces para investigar la eficacia terapéutica y los mecanismos moleculares de las fórmulas de decocción in vivo.

Resumen

La fórmula de decocción es la forma de dosificación más utilizada en la medicina tradicional china y se ha aplicado en la práctica clínica durante miles de años mediante administración transoral, que se caracteriza por un efecto rápido, una fácil absorción y un tratamiento individualizado basado en los síndromes específicos de los pacientes. La calidad de la fórmula de decocción es directamente responsable de la eficacia clínica de la medicina tradicional china; Por lo tanto, el proceso de estandarización de la fórmula de decocción es importante para evitar diferencias en la calidad de la decocción causadas por factores subjetivos. Mientras tanto, debido a las limitaciones de la realización de experimentos clínicos, los pequeños animales portadores de enfermedades humanas, como los ratones, se utilizan a menudo en la investigación médica para explorar la eficacia terapéutica y los mecanismos integrales de diferentes intervenciones, incluida la fórmula de decocción para la medicina tradicional china. En consecuencia, como método importante de administración transoral, la técnica de sonda nasogástrica especializada es particularmente importante para evitar posibles daños en el esófago y derrames de fármacos, lo que garantizará que se administre una cantidad igual de medicamento a cada animal modelo, lo que conducirá a resultados experimentales precisos. Además, el método estandarizado de preparación de la fórmula de decocción y la estrategia de sonda nasogástrica calificada son necesarios para proteger el bienestar animal y minimizar el número de animales utilizados. Aquí, informamos un proceso de estandarización detallado de la fórmula de decocción y la técnica de sonda nasogástrica con la decocción de Yiqi Jiedu en un modelo de ratón con osteosarcoma como ejemplo. La eficacia se evaluó por el volumen tumoral. Este protocolo maximizará la protección animal y mejorará la fiabilidad de los datos de investigación, proporcionando así estrategias eficaces para futuras investigaciones sobre la eficacia terapéutica y los mecanismos moleculares de la fórmula de decocción para la medicina tradicional china in vivo.

Introducción

La fórmula de decocción es la forma de dosificación más utilizada de la medicina tradicional china y los medicamentos líquidos ^1,2. La fórmula de decocción de la medicina tradicional china se procesa decociendo las hierbas en agua después de remojarlas, seguidas de un filtrado para desechar las heces.

Debido a que la fórmula de decocción puede individualizarse en función de las necesidades clínicas, especialmente en línea con las características del tratamiento basado en la evidencia en la medicina tradicional china, esta forma farmacéutica por vía transoral se ha aplicado en la práctica clínica durante miles de años con ventajas específicas e insustituibles ^3,4. La calidad de la fórmula de decocción está directamente relacionada con la eficacia clínica. Por lo tanto, la fórmula de decocción debe prepararse en base a los principios de los métodos de decocción estandarizados para garantizar que los ingredientes activos se extraigan y protejan al máximo³. Mientras tanto, los medicamentos listos para la decocción son la principal forma de hierbas chinas crudas utilizadas en la práctica clínica; las normas de calidad y los métodos de producción de los medicamentos listos para la decocción prescritos deben cumplir con las disposiciones de la Farmacopea China². Además, los medicamentos listos para la decocción prescritos deben remojarse en agua potable fría durante al menos 30 minutos antes de ser cocidos en una olla farmacéutica especial calentando⁵. Los estudios han demostrado que la mayoría de los ingredientes activos se pueden extraer decociendo dos veces, y el Código de Práctica para la Administración de Salas de Decocción de Medicinas Tradicionales Chinas en Instituciones Médicas también prescribe que la decocción se realice dos veces ^4,6,7. Si se prescriben hierbas chinas especiales, como una con textura dura o tónicos, se recomienda extender el tiempo de decocción. Los utensilios de decocción y los recipientes de almacenamiento que entran en contacto directo con la fórmula de decocción, a partir del recipiente en el que se remojan los medicamentos listos para la decocción prescritos, deben ser químicamente estables y tener tapas, como cazuelas, cerámica, vidrio y acero inoxidable. Sin embargo, no se deben utilizar productos de aluminio y plástico ordinario, mientras que el hierro y otros utensilios corrosivos deben prohibirse para evitar posibles reacciones químicas, que reducirán la eficacia terapéutica e incluso producirán efectos nocivos ^4,6,7.

Debido a las limitaciones de la realización de experimentos clínicos, los pequeños animales portadores de las enfermedades humanas, como los ratones, se utilizan a menudo en la investigación médica para explorar la eficacia terapéutica y los mecanismos integrales de diferentes intervenciones, incluida la fórmula de decocción de la medicina tradicional china ^8,9; Sin embargo, a diferencia de los humanos, las fórmulas de decocción deben prepararse todos los días, mezclarse y administrarse 2 veces al día en la práctica clínica. Los animales no pueden tomar voluntariamente sus medicamentos a tiempo con la dosis requerida, y la mayoría de los experimentos con animales relacionados con la medicina tradicional china se administran por vía oral con sonda nasogástrica en la actualidad. Las fórmulas de decocción utilizadas para los experimentos in vivo con animales deben prepararse con antelación, alícuotas, almacenarse a -20 °C y descongelarse justo antes de su uso ^3,4,10. Además, la inmovilización de animales de baja calidad y la manipulación de agujas por sonda aumentan el riesgo de lesiones innecesarias y emociones negativas. Por lo tanto, como método importante de administración transoral de fármacos, la técnica de sonda nasogástrica especializada es particularmente importante para evitar posibles lesiones esofágicas y derrames de fármacos, asegurando así que cada animal modelo reciba la misma cantidad de medicamentos herbales recetados para lograr resultados experimentales precisos. Aquí, proporcionamos un protocolo de sonda nasogástrica para la fórmula de decocción de la medicina tradicional china.

Protocolo

Este protocolo describe la técnica detallada de sonda nasogástrica en ratones modelo de osteosarcoma utilizando la decocción de Yiqi Jiedu como muestra. En este experimento se utilizaron ratones atímicos machos de cuatro semanas de edad (BALB/c desnudos) y se mantuvieron en la sala de cría de grado SPF del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Manejo de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái, cumplieron con el Código de Ética para Animales de Laboratorio (Número de Aprobación de Ética Animal: PZSHUTCM2304060007) y se llevaron a cabo en estricta conformidad con los requisitos internacionales relacionados con los animales de laboratorio.

1. Materiales

1. Obtenga los siguientes materiales: hierbas chinas (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, hierba de escutelaria de púas 31,5 g), jeringa de 1 ml y aguja de sonda nasogástrica de codo de 12 g/55 mm (Figura 1).

2. Determinación de la dosis

1. Calcule la dosis diaria de la siguiente manera: la dosis diaria para adultos con un peso corporal estándar de 60 kg es Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g y hierba de escutelaria de púas 9 g, con un total de 36 g de medicamento listo para la decocción, es decir, 0,6 g de medicamentos listos para la decocción/kg de peso corporal. Refiriéndose a las 12 veces para dosis equivalentes, 6 veces para dosis bajas y 24 veces para dosis altas entre los adultos con peso corporal estándar de 60 kg y los ratones con peso corporal estándar de 25 g de acuerdo con el área de superficie corporal¹¹, así como nuestros datos preliminares, use una proporción de dosis de 20 veces de la decocción de Yiqi Jiedu para los ratones en el estudio actual, Por lo tanto, la dosis para ratones fue de 12 g de medicamentos listos para la decocción/kg de peso corporal.
2. Calcule la dosis para cada ratón usando la ecuación:
   Dosis para ratón (peso corporal del soporte) = dosis para el adulto (peso corporal del soporte) x 20 (proporción de dosis equivalente designada).
   La dosis diaria de cada ratón es de 0,3 g [(12 g de medicamentos listos para decocción/1000 g de peso corporal) x 25 g de peso corporal] en 200 μL con una concentración final de 1,5 g/mL.
3. Calcule que el total de medicamentos listos para la decocción para ratones (n = 7) en el grupo de decocción de Yiqi Jiedu con administración por sonda nasogástrica durante 28 días es de 58,8 g. Concéntrelo a 39,2 ml para alcanzar una concentración final de 1,5 g/ml.
4. Teniendo en cuenta la posible pérdida de fármaco durante las etapas de decocción y sonda nasogástrica, y para facilitar el cálculo, prepare un total de 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, hierba de escutelaria de púas 31,5 g) de medicamento listo para la decocción, concentrado en un volumen final de 84 ml.

3. Origen y cultivo celular

1. Compre células de osteosarcoma 143B de origen humano en el banco de células ATCC.
2. Siembre 1 x 10⁶ 143B células en 10 mL de medio MEM que contenga 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en una placa de cultivo celular de 10 cm.
3. Cultivar células 143B a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% hasta que las células tengan una confluencia del 80%-90%.

4. Métodos de modelado

1. Recoja el cultivo de 143B al 80 % de las células confluentes, vuelva a suspenderlas en 6 ml de medio MEM al 10 % que contenga suero y mézclelas con gel de matriz de membrana basal en una proporción de volumen de 1:1 para hacer una suspensión celular con una concentración final de 1 x 10⁷ células/ml.
2. Inyectar 10 μL de la suspensión celular en la tibia izquierda de cada ratón atímico para establecer un modelo de ratón de osteosarcoma de xenoinjerto in situ , tal y como se describe en nuestra publicación anterior¹². Los pasos en resumen son los siguientes.
   1. Lave las celdas 2 veces con PBS. Tripsinar las células con 1,5 mL de tripsina al 0,25% durante 3 min. Agregue 6 ml de medio MEM al 10 % que contenga suero. Recoja las células en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Aspire 20 μL de suspensión celular en la cámara de la placa de recuento celular y calcule la concentración celular utilizando un contador celular automático. Centrifugar las celdas a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   3. Deseche el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender el gránulo celular en una matriz de membrana basal de 8,5 mg/ml y colóquelo en hielo.
   4. Anestesiar a los ratones exponiéndolos a un 2% de isoflurano y un 98% de oxígeno (caudal de oxígeno, 2 L/min). Aplique una pequeña cantidad de ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
   5. Realice todo el procedimiento en un área bien ventilada. Antes de la inyección de células de osteosarcoma, asegúrese de que cada ratón esté bajo anestesia profunda tocando suavemente el pie; Si el ratón sigue teniendo respuestas, como contracción o sacudida. Espere más tiempo si el mouse todavía tiene respuestas, como contracción o sacudida, hasta que estas respuestas desaparezcan.
   6. Coloque el ratón en posición supina. Sujete el tobillo del ratón con el pulgar y el índice y desinfecte el lugar de la inyección de la tibia con tres rondas alternas de betadine y un hisopo de etanol al 70%.
   7. Coloque la aguja en una jeringa de 1 ml y apunte la punta de la aguja hacia el lugar de la inyección, paralela al eje de la tibia. Inserte la aguja percutáneamente para perforar un orificio a través de la plataforma de la tibia hacia el extremo distal de la tibia.
   8. Cargue la suspensión de células de osteosarcoma que se colocó previamente en hielo en una jeringa de microvolumen y reemplace la jeringa de 1 ml en la tibia con la jeringa de microvolumen cargada de células de osteosarcoma. Inyecte lentamente aproximadamente 10 μl de suspensión de células de osteosarcoma (1 x 10⁷ células/ml) en la tibia de cada ratón atímico.
   9. Retire la jeringa de microvolumen del lugar de inyección y presione el lugar de inyección con el hisopo de algodón durante unos 30 segundos. Vuelva a colocar al ratón en una jaula limpia y observe su recuperación durante 10 minutos.

5. Preparación de la fórmula de decocción de la medicina tradicional china para la sonda nasogástrica (Figura 2)

1. Calcule la dosis según el paso 2.
2. Remoje todas las hierbas medicinales para la decocción, excepto la costosa hierba Ginseng, en agua potable con un nivel 3 cm más alto que la superficie del medicamento, durante 30 minutos, y luego realice la decocción 2 veces como se describe a continuación.
3. Realice la primera decocción calentando hasta que hierva sobre un fuego fuerte y luego calentando durante 15-25 minutos sobre un fuego suave. El fuego leve se refiere a un calor de baja potencia con temperaturas que suelen oscilar entre 80 °C y 100 °C, mientras que el fuego fuerte se refiere a un calor de alta potencia que suele oscilar entre 200 °C y 300 °C.
4. Vierta el líquido de decocción en un recipiente.
5. Realice la segunda decocción calentando las hierbas medicinales en agua potable, con un volumen suficiente para sumergir la superficie del medicamento, hasta que hierva a fuego fuerte, y luego calentando durante 15-25 minutos sobre un fuego suave.
6. Vierta el líquido de decocción en el mismo recipiente que en el paso 5.4.
7. Remojar y decoctar 42 g de Ginseng por separado, con agua potable 3 cm más alta que la superficie del medicamento, ya que es caro.
8. Realice la primera decocción de Ginseng remojado calentándolo a fuego fuerte durante 60 min.
   Vierta el líquido de decocción en el mismo recipiente que en el paso 5.4.
9. Realizar la segunda decocción de Ginseng en agua potable con un volumen suficiente para sumergir la superficie del medicamento, calentando a fuego suave durante 40 min. Vierta el líquido de decocción en el mismo recipiente que en el paso 5.4.
   NOTA: Los recipientes utilizados para la decocción deben ser químicamente estables, como cazuelas (las más utilizadas en la práctica clínica), cerámica, vidrio y acero inoxidable para evitar posibles reacciones químicas con las sustancias medicinales. Todo el líquido de decocción obtenido de diferentes pasos debe ponerse en el mismo recipiente.
10. Mezclar y filtrar el líquido de decocción con tres capas de gasa fijadas en la boca de un vaso medidor con gomas elásticas.
11. Hervir la decocción filtrada a fuego fuerte en una olla, luego cambiar a fuego suave y mantener el fuego suave hasta alcanzar la concentración objetivo (un volumen final de 84 ml con una concentración final de 1,5 g/ml).
12. Preparar 21 mL de alícuotas de la decocción concentrada según la dosis requerida para la administración intragástrica durante 1 semana, y almacenar las alícuotas en un refrigerador a -20 °C.

6. Administración de sonda nasogástrica en ratones mediante el uso de un dispositivo de sonda nasogástrica

1. Coloque el mouse sobre la superficie de la jaula del mouse u otra superficie más rugosa.
2. Agarra la cola del ratón con el pulgar y el índice de la mano derecha. Luego, agarra el cuello del ratón con el pulgar, el índice y el dedo medio de la mano izquierda.
3. Sostén la cola del ratón con los otros dos dedos de la mano izquierda para hacer la cabeza, el cuello y el cuerpo del ratón en línea recta.
   NOTA: Asegúrese de mantener el mouse relajado durante todo el proceso de agarre. Si el ratón sigue luchando por moverse, el proceso de agarre debe realizarse hasta que el ratón esté relajado.
4. Sostenga el dispositivo de sonda nasogástrica en la mano derecha y cargue 200 μL de fórmula de decocción para un ratón con 20 g de peso corporal (100 μL de fórmula de decocción/10 g de peso corporal del ratón).
5. Inserte la aguja de sonda nasogástrica en la boca desde la esquina y empuje la lengua contra la mandíbula superior del ratón.
6. Mantenga el cuerpo del ratón en la misma dirección y empuje suavemente la aguja de sonda nasogástrica hacia el estómago a lo largo del esófago hasta que queden unos 10 mm de la aguja de sonda nasogástrica fuera.
   NOTA: Hay una sensación de vacío cuando la aguja de sonda nasogástrica entra en el esófago. La longitud de la aguja de sonda nasogástrica insertada en el ratón debe medirse hasta la parte superior del esternón. La longitud total de la aguja de sonda nasogástrica es de 60 mm (Figura 3), por lo tanto, se deben insertar aproximadamente 50 mm de la aguja de sonda nasogástrica en el cuerpo del ratón antes de inyectar la fórmula de decocción en el estómago del ratón.
7. Inyecte la fórmula de decocción en el estómago del ratón. Encontrarse con resistencia o líquido que sale de la comisura de la boca significa una mala colocación de la aguja de sonda nasogástrica, que debe evitarse. Además, la velocidad de inyección debe reducirse si la fórmula de decocción es espesa.
8. Suelta el ratón y obsérvalos durante 10 min. La sonda nasogástrica es exitosa si no se observa ninguna anomalía respiratoria y devuelve al ratón a la jaula (Figura 4).

7. Curso del tratamiento

1. Para explorar la eficacia terapéutica de la decocción de Yiqi Jiedu, establezca un grupo de control y un grupo de decocción de Yiqi Jiedu. Para los ratones del grupo de control, administrar solución salina fisiológica, una vez al día durante 28 días. En el caso de los ratones del grupo de decocción Yiqi Jiedu, administre la decocción Yiqi Jiedu una vez al día durante 28 días.

8. Reacciones adversas

1. Observe de cerca el estado de los ratones después de volver a colocarlos en la jaula, incluida la pérdida de peso y la disminución del estado mental debido a la incapacidad de los alimentos para ingresar al estómago.
2. Los ratones experimentarán dificultad para respirar y falta de aliento debido a la obstrucción traqueal causada por los alimentos y toserán en un intento de despejar la tráquea. Si se observa alguno de estos síntomas durante la sonda nasogástrica, deténgala inmediatamente y practique la eutanasia a los ratones.

Resultados

El efecto inhibidor de la decocción de Yiqi Jiedu sobre el crecimiento del osteosarcoma in vivo se determinó en un modelo de ratón de osteosarcoma de xenoinjerto intratibial, que se preparó inyectando las células de osteosarcoma 143B en la tibia de ratones atímicos. La decocción de Yiqi Jiedu se administró a los ratones del grupo de decocción de Yiqi Jiedu por sonda nasogástrica durante 28 días a partir del segundo día de la inyección de 143B. Se administró solución salina fisiológica a los raton...

Discusión

La eficacia clínica de las hierbas prescritas en la medicina tradicional china se asocia en gran medida con la dosis administrada y la forma farmacéutica; Por lo tanto, el establecimiento de una estrategia de decocción estandarizada y un proceso de administración calificado son necesarios en la práctica clínica, así como en la mejora de la confiabilidad de los resultados experimentales.

En este estudio, primero proporcionamos una estrategia detallada para la decocción estandarizada de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells