Strategia del sonda gastrica per la formula di decotto della medicina tradizionale cinese nei topi modello di osteosarcoma

Riepilogo

Il protocollo fornisce un processo di standardizzazione dettagliato della formula di decotto e della tecnica del gavage con il decotto Yiqi Jiedu nel modello murino di osteosarcoma come esempio. Descrive la protezione degli animali e migliora l'affidabilità dei dati della ricerca, fornendo strategie efficaci per studiare l'efficacia terapeutica e i meccanismi molecolari delle formule di decotto in vivo.

Abstract

La formula del decotto è la forma di dosaggio più comunemente usata nella medicina tradizionale cinese e applicata nella pratica clinica da migliaia di anni mediante somministrazione transorale, che è caratterizzata da un effetto rapido, un facile assorbimento e un trattamento individualizzato in base alle sindromi specifiche dei pazienti. La qualità della formula del decotto è direttamente responsabile dell'efficacia clinica della medicina tradizionale cinese; Pertanto, il processo di standardizzazione della formula del decotto è importante per evitare differenze nella qualità del decotto causate da fattori soggettivi. Nel frattempo, a causa dei limiti dell'esecuzione di esperimenti clinici, i piccoli animali portatori di malattie umane, come i topi, sono spesso utilizzati nella ricerca medica per esplorare l'efficacia terapeutica e i meccanismi completi di diversi interventi, inclusa la formula del decotto per la medicina tradizionale cinese. Di conseguenza, essendo un importante metodo di somministrazione transorale, la tecnica del gavage è particolarmente importante per evitare potenziali danni all'esofago e fuoriuscite di farmaci, che garantiranno la somministrazione di una quantità uguale di farmaco a ciascun animale modello, portando a risultati sperimentali accurati. Inoltre, il metodo standardizzato di preparazione della formula di decotto e la strategia di gavage qualificata sono necessari per proteggere il benessere degli animali e ridurre al minimo il numero di animali utilizzati. Qui, abbiamo riportato un processo di standardizzazione dettagliato della formula di decotto e della tecnica del gavage con il decotto Yiqi Jiedu nel modello murino di osteosarcoma come esempio. L'efficacia è stata valutata in base al volume del tumore. Questo protocollo massimizzerà la protezione degli animali e migliorerà l'affidabilità dei dati della ricerca, fornendo quindi strategie efficaci per studiare in futuro l'efficacia terapeutica e i meccanismi molecolari della formula di decotto per la medicina tradizionale cinese in vivo.

Introduzione

La formula del decotto è la forma di dosaggio più comunemente usata della medicina tradizionale cinese e dei farmaci medicinali liquidi ^1,2. La formula del decotto della medicina tradizionale cinese viene elaborata decondo le erbe in acqua dopo essere state messe a bagno, seguite da un filtraggio per scartare la feccia.

Poiché la formula del decotto può essere individualizzata in base alle necessità cliniche, soprattutto in linea con le caratteristiche del trattamento basato sull'evidenza nella medicina tradizionale cinese, questa forma di dosaggio tramite somministrazione transorale è stata applicata nella pratica clinica per migliaia di anni con vantaggi specifici e insostituibili ^3,4. La qualità della formula del decotto è direttamente correlata all'efficacia clinica. Pertanto, la formula del decotto deve essere preparata in base ai principi dei metodi di decozione standardizzati per garantire che i principi attivi siano estratti e protetti al massimo³. Nel frattempo, i farmaci pronti per il decotto sono la principale forma di erbe cinesi crude utilizzate nella pratica clinica; gli standard di qualità e i metodi di produzione dei medicinali pronti per il decotto prescritti devono essere conformi alle disposizioni della farmacopea cinese². Inoltre, i medicinali pronti per il decotto prescritti devono essere immersi in acqua potabile fredda per almeno 30 minuti prima di essere decotti in una speciale pentola farmaceutica riscaldando⁵. Gli studi hanno dimostrato che la maggior parte dei principi attivi può essere estratta per decozione per due volte, e il Codice di condotta per la somministrazione di sale di decottaggio di medicine tradizionali cinesi nelle istituzioni mediche prescrive anche il decotto da fare due volte ^4,6,7. Se vengono prescritte erbe cinesi speciali, come una con consistenza dura o tonici, si consiglia di prolungare il tempo di decotto. Gli utensili per il decotto e i contenitori per la conservazione che entrano direttamente in contatto con la formula del decotto, a partire dal contenitore in cui vengono immersi i medicinali pronti per il decotto prescritti, devono essere chimicamente stabili e dotati di coperchi, come casseruole, ceramica, vetro e acciaio inossidabile. Tuttavia, l'alluminio e i normali prodotti in plastica non dovrebbero essere utilizzati, mentre il ferro e altri utensili corrosivi dovrebbero essere vietati per evitare possibili reazioni chimiche, che ridurrebbero l'efficacia terapeutica e produrrebbero persino effetti dannosi ^4,6,7.

A causa dei limiti dell'esecuzione di esperimenti clinici, i piccoli animali portatori di malattie umane, come i topi, sono spesso utilizzati nella ricerca medica per esplorare l'efficacia terapeutica e i meccanismi completi di diversi interventi, tra cui la formula del decotto della medicina tradizionale cinese ^8,9; Tuttavia, a differenza degli esseri umani, le formule di decotto dovrebbero essere preparate ogni giorno, mescolate insieme e somministrate fresche 2 volte al giorno nella pratica clinica. Gli animali non sono in grado di assumere volontariamente i loro farmaci in tempo con il dosaggio richiesto, e la maggior parte degli esperimenti sugli animali relativi alla medicina tradizionale cinese sono attualmente somministrazione orale basata sul gavage delle formule di decotto. Le formule di decotto utilizzate per gli esperimenti in vivo sugli animali devono essere preparate in anticipo, aliquotate, conservate a -20 °C e scongelate appena prima dell'uso ^3,4,10. Inoltre, l'immobilizzazione degli animali scadente e la manipolazione dell'ago da assembramento aumentano il rischio di lesioni inutili ed emozioni negative. Pertanto, come importante metodo di somministrazione transorale di farmaci, la tecnica del gavage è particolarmente importante per evitare possibili lesioni esofagee e fuoriuscite di farmaci, garantendo così che ogni animale modello riceva una quantità uguale di medicina erboristica prescritta per ottenere risultati sperimentali accurati. Qui, forniamo un protocollo di gavage per la formula di decotto della medicina tradizionale cinese.

Protocollo

Questo protocollo descrive la tecnica dettagliata del gavage nei topi modello di osteosarcoma utilizzando il decotto Yiqi Jiedu come campione. In questo esperimento sono stati utilizzati topi atimici maschi di quattro settimane (BALB/c nude) e tenuti nella sala di allevamento di grado SPF del Laboratory Animal Center dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Animal Management and Committee dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai, sono stati rispettati dal Codice Etico per gli Animali da Laboratorio (Animal Ethics Approval Number: PZSHUTCM2304060007) e condotti in stretta conformità con i requisiti internazionali relativi agli animali da laboratorio.

1. Materiali

1. Procurarsi i seguenti materiali: erbe cinesi (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Scutellaria spinata 31,5 g), siringa da 1 ml e ago da 12 G/55 mm (Figura 1).

2. Determinazione del dosaggio

1. Calcola la dose giornaliera come segue: la dose giornaliera per gli adulti con un peso corporeo standard di 60 kg è Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g e Scutellaria spinata erba 9 g, con un totale di 36 g di farmaco pronto per il decotto, cioè 0,6 g di farmaci pronti per il decotto/kg di peso corporeo. Riferendosi alle 12 volte per la dose equivalente, 6 volte per la dose bassa e 24 volte per la dose alta tra gli adulti con peso corporeo standard di 60 kg e i topi con peso corporeo standard di 25 g in base alla superficie corporea¹¹, così come i nostri dati preliminari, utilizzare un rapporto di dose 20 volte del decotto Yiqi Jiedu per i topi nello studio corrente, Pertanto, il dosaggio per i topi era di 12 g di farmaci pronti per il decotto/kg di peso corporeo.
2. Calcola il dosaggio per ogni topo usando l'equazione:
   Dosaggio per topo (peso corporeo in piedi) = dosaggio per adulto (peso corporeo in piedi) x 20 (rapporto di dose equivalente designato).
   La dose giornaliera di ciascun topo è di 0,3 g [(12 g di farmaci pronti per il decotto/1000 g di peso corporeo) x 25 g di peso corporeo] in 200 μL con una concentrazione finale di 1,5 g/mL.
3. Calcolare che il totale dei farmaci pronti per il decotto per topi (n=7) nel gruppo di decotti Yiqi Jiedu con somministrazione di sonda gastrica per 28 giorni sia di 58,8 g. Concentrare a 39,2 mL per raggiungere una concentrazione finale di 1,5 g/mL.
4. Considerando la possibile perdita di farmaco durante le fasi di decotto e gavage, e per comodità di calcolo, preparare un totale di 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Erba di scutellaria spinata 31,5 g) farmaco pronto per il decotto, concentrato in un volume finale di 84 ml.

3. Fonte e coltura cellulare

1. Acquista cellule di osteosarcoma 143B derivate dall'uomo dalla banca di cellule ATCC.
2. Seminare 1 x 10⁶ cellule 143B in 10 mL di terreno MEM contenente il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in una piastra di coltura cellulare di 10 cm.
3. Coltivare cellule 143B a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ fino a quando le cellule sono confluenti all'80%-90%.

4. Metodi di modellazione

1. Raccogliere le cellule 143B coltivate all'80% confluenti, risospendere in 6 mL di terreno MEM contenente siero al 10% e miscelare con gel di matrice di membrana basale con un rapporto di volume di 1:1 per ottenere una sospensione cellulare con una concentrazione finale di 1 x 10⁷ cellule/mL.
2. Iniettare 10 μL della sospensione cellulare nella tibia sinistra di ciascun topo atimico per stabilire un modello murino di osteosarcoma xenotrapianto in situ , come descritto nella nostra precedente pubblicazione¹². I passaggi in breve sono i seguenti.
   1. Lavare le celle 2 volte con PBS. Tripsinizzare le cellule con 1,5 ml di tripsina allo 0,25% per 3 minuti. Aggiungere 6 mL di terreno MEM contenente siero al 10%. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.
   2. Aspirare 20 μL di sospensione cellulare nella camera della piastra contacellule e calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore automatico di cellule. Centrifugare le cellule a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare in una matrice di membrana basale da 8,5 mg/mL e metterlo su ghiaccio.
   4. Anestetizzare i topi esponendoli al 2% di isoflurano e al 98% di ossigeno (portata di ossigeno, 2 L/min). Applicare una piccola quantità di unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   5. Eseguire l'intera procedura in un'area ben ventilata. Prima dell'iniezione di cellule di osteosarcoma, assicurarsi che ogni topo sia in anestesia profonda toccando delicatamente il piede; se il mouse ha ancora delle risposte, come contrazione o scatto. Attendi più tempo se il mouse ha ancora risposte, come contrazione o scatto, fino a quando queste risposte scompaiono.
   6. Posizionare il mouse in posizione supina. Tenere la caviglia del topo usando il pollice e l'indice e disinfettare il sito di iniezione della tibia con tre cicli alternati di betadine e tampone di etanolo al 70%.
   7. Collegare l'ago a una siringa da 1 mL e puntare la punta dell'ago verso il sito di iniezione parallelamente all'asse della tibia. Inserire percutaneamente l'ago per praticare un foro attraverso la piattaforma della tibia verso l'estremità distale della tibia.
   8. Caricare la sospensione di cellule di osteosarcoma precedentemente poste sul ghiaccio in una siringa per microvolumi e sostituire la siringa da 1 mL nella tibia con la siringa per microvolumi caricata con cellule per osteosarcoma. Iniettare lentamente circa 10 μL di sospensione di cellule di osteosarcoma (1 x^{10 7} cellule/mL) nella tibia di ciascun topo atimico.
   9. Rimuovere la siringa per microvolumi dal sito di iniezione e premere il sito di iniezione con il batuffolo di cotone per circa 30 secondi. Rimetti il topo in una gabbia pulita e osserva il suo recupero per 10 minuti.

5. Preparazione della formula di decotto della medicina tradizionale cinese per il gavage (Figura 2)

1. Calcolare il dosaggio come da punto 2.
2. Immergere tutte le erbe medicinali per il decotto, ad eccezione della costosa erba Ginseng, in acqua potabile con un livello di 3 cm più alto della superficie del medicinale, per 30 minuti, quindi eseguire il decotto 2 volte come descritto di seguito.
3. Eseguire il primo decotto riscaldando fino all'ebollizione a fuoco forte, quindi riscaldando per 15-25 minuti a fuoco leggero. Il fuoco lieve si riferisce a un calore a bassa potenza con temperature tipicamente comprese tra 80 °C e 100 °C, mentre il fuoco forte si riferisce a un calore ad alta potenza che in genere va da 200 °C a 300 °C.
4. Versare il liquido di decotto in un contenitore.
5. Eseguire il secondo decotto riscaldando le erbe medicinali in acqua potabile, con un volume appena sufficiente a sommergere la superficie della medicina, fino a farle bollire a fuoco forte, quindi riscaldarle per 15-25 minuti a fuoco leggero.
6. Versare il liquido di decotto nello stesso contenitore del passaggio 5.4.
7. Mettere in ammollo e decofare separatamente 42 g di Ginseng, con acqua potabile 3 cm più in alto rispetto alla superficie del medicinale, poiché è costoso.
8. Eseguire il primo decotto di Ginseng ammollato riscaldandolo a fuoco vivo per 60 min.
   Versare il liquido di decotto nello stesso contenitore del passaggio 5.4.
9. Eseguire il secondo decotto di Ginseng in acqua potabile con un volume appena sufficiente a sommergere la superficie del medicinale, riscaldando a fuoco dolce per 40 min. Versare il liquido di decotto nello stesso contenitore del passaggio 5.4.
   NOTA: I contenitori utilizzati per il decotto devono essere chimicamente stabili, come casseruole (le più comunemente utilizzate nella pratica clinica), ceramica, vetro e acciaio inossidabile per evitare possibili reazioni chimiche con le sostanze medicinali. Tutto il liquido di decotto ottenuto da diversi passaggi deve essere messo nello stesso contenitore.
10. Mescolare e filtrare il liquido di decotto utilizzando tre strati di garza fissati all'imboccatura di un misurino con elastici.
11. Far bollire il decotto filtrato a fuoco forte in una pentola, quindi passare a fuoco dolce e mantenere il fuoco dolce fino a raggiungere la concentrazione target (un volume finale di 84 ml con una concentrazione finale di 1,5 g/mL).
12. Preparare aliquote da 21 mL del decotto concentrato secondo la dose richiesta per la somministrazione intragastrica per 1 settimana e conservare le aliquote in frigorifero a -20 °C.

6. Somministrazione di sonda gastrica nei topi mediante l'utilizzo di un dispositivo di sonda gastrica

1. Posizionare il mouse sulla superficie della gabbia del mouse o su un'altra superficie più ruvida.
2. Afferra la coda del mouse con il pollice e l'indice della mano destra. Quindi, afferra il collo del mouse con il pollice, l'indice e il medio della mano sinistra.
3. Tieni la coda del mouse con le altre due dita della mano sinistra per formare la testa, il collo e il corpo del mouse in linea retta.
   NOTA: Assicurarsi di mantenere il mouse rilassato durante l'intero processo di presa. Se il mouse continua a lottare per muoversi, il processo di presa dovrebbe essere eseguito fino a quando il mouse non è rilassato.
4. Tenere il dispositivo a gas nella mano destra e caricare 200 μL di formula di decotto per un topo con 20 g di peso corporeo (100 μL di formula di decotto/10 g di peso corporeo del topo).
5. Inserire l'ago da sonda nella bocca dall'angolo e spingere la lingua contro la mascella superiore del topo.
6. Tenere il corpo del topo nella stessa direzione e spingere delicatamente l'ago del sonda gastrica verso lo stomaco lungo l'esofago fino a quando non rimangono all'esterno circa 10 mm dell'ago del sonda.
   NOTA: C'è una sensazione di vuoto quando l'ago del sonda entra nell'esofago. La lunghezza dell'ago da sonda inserita nel topo deve essere misurata fino alla sommità dello sterno. La lunghezza totale dell'ago del sonda gastrica è di 60 mm (Figura 3), pertanto, circa 50 mm dell'ago del sonda gastrica devono essere inseriti nel corpo del topo prima che la formula del decotto venga iniettata nello stomaco del topo.
7. Iniettare la formula del decotto nello stomaco del topo. Incontrare resistenza o liquido che fuoriesce dall'angolo della bocca significa un errato posizionamento dell'ago da sonda, che deve essere evitato. Inoltre, la velocità di iniezione deve essere rallentata se la formula del decotto è densa.
8. Rilasciare il mouse e osservarli per 10 minuti. Il gavage ha successo se non si osserva alcuna anomalia respiratoria e se il topo viene riportato nella gabbia (Figura 4).

7. Svolgimento del trattamento

1. Per esplorare l'efficacia terapeutica del decotto di Yiqi Jiedu, creare un gruppo di controllo e un gruppo di decottaggio di Yiqi Jiedu. Per i topi del gruppo di controllo, somministrare soluzione fisiologica, una volta al giorno per 28 giorni. Per i topi del gruppo di decotti Yiqi Jiedu, somministrare il decotto Yiqi Jiedu una volta al giorno per 28 giorni.

8. Reazioni avverse

1. Osserva attentamente lo stato dei topi dopo essere stati rimessi nella gabbia, compresa la perdita di peso e la diminuzione dello stato mentale a causa dell'incapacità del cibo di entrare nello stomaco.
2. I topi sperimenteranno difficoltà respiratorie e mancanza di respiro a causa dell'ostruzione tracheale causata dal cibo e tossiranno nel tentativo di liberare la trachea. Se si osserva uno di questi sintomi durante il gavage, interrompere immediatamente il gavage e sopprimere i topi.

Risultati

L'effetto inibitorio del decotto Yiqi Jiedu sulla crescita dell'osteosarcoma in vivo è stato determinato in un modello murino di osteosarcoma xenotrapianto intra-tibiale, che è stato preparato iniettando le cellule di osteosarcoma 143B nella tibia di topi atimici. Il decotto di Yiqi Jiedu è stato somministrato ai topi del gruppo di decotti di Yiqi Jiedu per via endovenosa per 28 giorni a partire dal secondo giorno dell'iniezione di 143B. La soluzione fisiologica è stata somministrata ai topi del gruppo di co...

Discussione

L'efficacia clinica delle erbe prescritte nella medicina tradizionale cinese è in gran parte associata alla dose somministrata e alla forma di dosaggio; Pertanto, l'istituzione di una strategia di decotto standardizzata e di un processo di somministrazione qualificato sono necessari nella pratica clinica, nonché per migliorare l'affidabilità dei risultati sperimentali.

In questo studio, abbiamo prima fornito una strategia dettagliata per il decotto standardizzato di erbe cinesi utilizzate n...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells