Sondenstrategie für die Sudformel der Traditionellen Chinesischen Medizin bei Osteosarkom-Modellmäusen

Zusammenfassung

Das Protokoll bietet einen detaillierten Standardisierungsprozess der Abkochformel und der Sondentechnik am Beispiel der Yiqi Jiedu-Abkochung im Osteosarkom-Mausmodell. Es beschreibt den Tierschutz und verbessert die Zuverlässigkeit von Forschungsdaten, indem es effektive Strategien zur Untersuchung der therapeutischen Wirksamkeit und der molekularen Mechanismen von Abkochrezepturen in vivo bietet.

Zusammenfassung

Die Suktionsformel ist die am häufigsten verwendete Darreichungsform in der traditionellen chinesischen Medizin und wird seit Tausenden von Jahren in der klinischen Praxis durch transorale Verabreichung angewendet, die sich durch schnelle Wirkung, einfache Absorption und individuelle Behandlung basierend auf den spezifischen Syndromen der Patienten auszeichnet. Die Qualität der Abkochformel ist direkt für die klinische Wirksamkeit der traditionellen chinesischen Medizin verantwortlich. Daher ist der Standardisierungsprozess der Abkochformel wichtig, um Unterschiede in der Abkochungsqualität zu vermeiden, die durch subjektive Faktoren verursacht werden. Aufgrund der Einschränkungen bei der Durchführung klinischer Experimente werden kleine Tiere, die menschliche Krankheiten tragen, wie Mäuse, häufig in der medizinischen Forschung eingesetzt, um die therapeutische Wirksamkeit und die umfassenden Mechanismen verschiedener Interventionen zu untersuchen, einschließlich der Abkochformel für die traditionelle chinesische Medizin. Folglich ist die geschickte Sondentechnik als wichtige transorale Verabreichungsmethode besonders wichtig, um mögliche Schäden an der Speiseröhre und das Verschütten von Medikamenten zu vermeiden, wodurch sichergestellt wird, dass jedem Modelltier die gleiche Menge an Arzneimitteln verabreicht wird, was zu genauen Versuchsergebnissen führt. Darüber hinaus sind die standardisierte Methode der Herstellung von Abkochformeln und eine geschickte Sondenstrategie notwendig, um das Wohlergehen der Tiere zu schützen und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. Hier berichteten wir über einen detaillierten Standardisierungsprozess der Abkochformel und der Sondentechnik mit Yiqi Jiedu Abkochung im Osteosarkom-Mausmodell als Beispiel. Die Wirksamkeit wurde anhand des Tumorvolumens bewertet. Dieses Protokoll wird den Tierschutz maximieren und die Zuverlässigkeit der Forschungsdaten verbessern und somit wirksame Strategien für die zukünftige Untersuchung der therapeutischen Wirksamkeit und der molekularen Mechanismen der Abkochformel für die traditionelle chinesische Medizin in vivo bieten.

Einleitung

Die Suktionsformel ist die am häufigsten verwendete Darreichungsform der traditionellen chinesischen Medizin und der flüssigen Arzneimittel ^1,2. Die Abkochformel der traditionellen chinesischen Medizin wird verarbeitet, indem die Kräuter nach dem Einweichen in Wasser abgekocht und anschließend gefiltert werden, um den Bodensatz zu entsorgen.

Da die Abkochformel auf der Grundlage klinischer Notwendigkeiten individualisiert werden kann, insbesondere im Einklang mit den Merkmalen der evidenzbasierten Behandlung in der traditionellen chinesischen Medizin, wird diese Darreichungsform über transorale Verabreichung seit Tausenden von Jahren in der klinischen Praxis mit spezifischen und unersetzlichen Vorteilen angewendet ^3,4. Die Qualität der Abkochformel steht in direktem Zusammenhang mit der klinischen Wirksamkeit. Daher muss die Abkochformel auf der Grundlage der Prinzipien für die standardisierten Abkochmethoden hergestellt werden, um sicherzustellen, dass die Wirkstoffe maximal extrahiert und geschützt werden³. In der Zwischenzeit sind abkochfertige Medikamente die Hauptform von rohen chinesischen Kräutern, die in der klinischen Praxis verwendet werden. Die Qualitätsstandards und Herstellungsmethoden der verschriebenen abkochfertigen Arzneimittel müssen den Bestimmungen des Chinesischen Arzneibuchs^{entsprechen 2}. Darüber hinaus müssen die verschriebenen abkochfertigen Arzneimittel mindestens 30 Minuten lang in kaltem Trinkwasser eingeweicht werden, bevor sie in einem speziellen pharmazeutischen Topf^{durch Erhitzen 5} abgekocht werden. Studien haben gezeigt, dass die meisten Wirkstoffe durch zweimaliges Abkochen extrahiert werden können, und der Verhaltenskodex für die Verabreichung von Abkochräumen traditioneller chinesischer Arzneimittel in medizinischen Einrichtungen schreibt ebenfalls vor, dass das Abkochen zweimal durchgeführt werden^{muss 4,6,7}. Wenn spezielle chinesische Kräuter, wie z. B. eines mit harter Textur oder Tonika, verschrieben werden, wird empfohlen, die Abkochzeit zu verlängern. Die Abkochutensilien und Vorratsbehälter, die direkt mit der Abkochformel in Berührung kommen, ausgehend von dem Behälter, in dem die verschriebenen abkochfertigen Medikamente eingeweicht werden, sollten chemisch stabil sein und Deckel wie Aufläufe, Keramik, Glas und Edelstahl haben. Aluminium und gewöhnliche Kunststoffprodukte sollten jedoch nicht verwendet werden, während Eisen und andere ätzende Utensilien verboten werden sollten, um mögliche chemische Reaktionen zu vermeiden, die die therapeutische Wirksamkeit verringern und sogar schädliche Auswirkungen haben ^4,6,7.

Aufgrund der Einschränkungen bei der Durchführung klinischer Experimente werden kleine Tiere, die menschliche Krankheiten tragen, wie Mäuse, häufig in der medizinischen Forschung verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit und die umfassenden Mechanismen verschiedener Interventionen zu untersuchen, einschließlich der Abkochformel der traditionellen chinesischen Medizin ^8,9; Im Gegensatz zum Menschen sollten die Abkochrezepturen jedoch jeden Tag zubereitet, miteinander gemischt und in der klinischen Praxis 2x täglich frisch verabreicht werden. Tiere sind nicht in der Lage, ihre Medikamente freiwillig rechtzeitig in der erforderlichen Dosierung einzunehmen, und die meisten Tierversuche im Zusammenhang mit der traditionellen chinesischen Medizin sind derzeit eine orale Verabreichung der Abkochformeln auf Sondenbasis. Die für In-vivo-Tierversuche verwendeten Abkochformeln sollten im Voraus hergestellt, aliquotiert, bei -20 °C gelagert und kurz vor der Verwendung aufgetaut werden ^3,4,10. Darüber hinaus erhöhen minderwertige Tierimmobilisierung und die Manipulation der Sondennadel das Risiko unnötiger Verletzungen und negativer Emotionen. Daher ist die geschickte Sondentechnik als wichtige Methode der transoralen Arzneimittelverabreichung besonders wichtig, um mögliche Verletzungen der Speiseröhre und das Verschütten von Medikamenten zu vermeiden und so sicherzustellen, dass jedes Modelltier die gleiche Menge an verschriebener pflanzlicher Medizin erhält, um genaue experimentelle Ergebnisse zu erzielen. Hier stellen wir ein Sondenprotokoll für die Abkochungsformel der traditionellen chinesischen Medizin zur Verfügung.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Sondentechnik bei Osteosarkom-Modellmäusen unter Verwendung des Yiqi Jiedu-Suds als Probe. Vier Wochen alte, männliche athyme Mäuse (BALB/c nackt) wurden in diesem Experiment verwendet und im SPF-Zuchtraum des Laboratory Animal Center der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine gehalten. Alle Tierversuche wurden vom Animal Management and Committee der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt, entsprachen dem Ethikkodex für Labortiere (Animal Ethics Approval Number: PZSHUTCM2304060007) und wurden in strikter Übereinstimmung mit den internationalen Anforderungen in Bezug auf Labortiere durchgeführt.

1. Materialien

1. Besorgen Sie sich die folgenden Materialien: Chinesische Kräuter (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Stachelkraut 31,5 g), 1 ml Spritze und 12 G/55 mm Ellenbogensondennadel (Abbildung 1).

2. Dosierungsbestimmung

1. Berechnen Sie die Tagesdosis wie folgt: Die Tagesdosis für Erwachsene mit einem Standardkörpergewicht von 60 kg beträgt Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g und Stachelkraut 9 g, mit insgesamt 36 g abkochfertigen Arzneimitteln, dh 0,6 g abkochfertigen Arzneimitteln/kg Körpergewicht. Unter Bezugnahme auf das 12-fache für die Äquivalentdosis, das 6-fache für die niedrige Dosis und das 24-fache für die hohe Dosis zwischen den Erwachsenen mit einem Standardkörpergewicht von 60 kg und den Mäusen mit einem Standardkörpergewicht von 25 g gemäß der Körperoberfläche¹¹ sowie unsere vorläufigen Daten verwenden wir ein 20-faches Dosisverhältnis von Yiqi Jiedu-Abkochung für die Mäuse in der aktuellen Studie, Daher betrug die Dosierung für Mäuse 12 g abkochfertige Arzneimittel/kg Körpergewicht.
2. Berechnen Sie die Dosierung für jede Maus mithilfe der Gleichung:
   Dosierung für Maus (Körpergewicht des Standes) = Dosierung für Erwachsene (Körpergewicht des Standes) x 20 (angegebenes äquivalentes Dosisverhältnis).
   Die Tagesdosis jeder Maus beträgt 0,3 g [(12 g abkochfertige Arzneimittel/1000 g Körpergewicht) x 25 g Körpergewicht] in 200 μl mit einer Endkonzentration von 1,5 g/ml.
3. Berechnen Sie die Gesamtzahl der abkochfertigen Arzneimittel für Mäuse (n = 7) in der Yiqi Jiedu Abkochgruppe mit Sondengabe für 28 Tage auf 58,8 g. Konzentrieren Sie dies auf 39,2 ml, um eine Endkonzentration von 1,5 g/ml zu erreichen.
4. Bereiten Sie unter Berücksichtigung eines möglichen Arzneimittelverlusts während der Abkochungs- und Sondenphase und zur Vereinfachung der Berechnung insgesamt 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, Stachelkraut 31,5 g) abkochfertiges Arzneimittel vor und konzentrieren Sie es auf ein Endvolumen von 84 ml.

3. Zellquelle und Kultur

1. Kaufen Sie humane 143B-Osteosarkomzellen von der ATCC-Zellbank.
2. Samen 1 x 10⁶ 143B-Zellen in 10 ml MEM-Medium mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einer 10-cm-Zellkulturschale.
3. Kultivieren Sie 143B-Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ -Inkubator, bis die Zellen zu 80 % bis 90 % konfluent sind.

4. Modellierungsmethoden

1. Sammeln Sie die 80 % konfluenten kultivierten 143B-Zellen, resuspendieren Sie sie in 6 ml 10 % serumhaltiges MEM-Medium und mischen Sie sie mit Basalmembran-Matrixgel in einem Volumenverhältnis von 1:1, um eine Zellsuspension mit einer Endkonzentration von 1 x 10⁷ Zellen/ml herzustellen.
2. Injizieren Sie 10 μl der Zellsuspension in die linke Tibia jeder athymen Maus, um ein In-situ-Xenotransplantat-Osteosarkom-Mausmodell zu erstellen, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung^{beschrieben 12}. Die Schritte in Kürze sind wie folgt.
   1. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS. Trypsinisieren Sie die Zellen mit 1,5 ml 0,25% Trypsin für 3 Minuten. Fügen Sie 6 ml 10% serumhaltiges MEM-Medium hinzu. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Aspirieren Sie 20 μl Zellsuspension in die Kammer der Zellzählplatte und berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   3. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 8,5 mg/ml Basalmembranmatrix und legen Sie es auf Eis.
   4. Betäuben Sie die Mäuse, indem Sie sie 2% Isofluran und 98% Sauerstoff (Sauerstoffflussrate, 2 l/min) aussetzen. Tragen Sie eine kleine Menge Tiersalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
   5. Führen Sie den gesamten Vorgang in einem gut belüfteten Bereich durch. Stellen Sie vor der Injektion von Osteosarkomzellen sicher, dass jede Maus unter tiefer Narkose steht, indem Sie den Fuß sanft berühren. , wenn die Maus immer noch Antworten hat, wie z. B. Zucken oder Ruckeln. Warten Sie länger, wenn die Maus immer noch Reaktionen wie Zucken oder Ruckeln hat, bis diese Antworten verschwinden.
   6. Legen Sie die Maus in Rückenlage. Halten Sie den Knöchel der Maus mit Daumen und Zeigefinger fest und desinfizieren Sie die Injektionsstelle des Schienbeins mit drei abwechselnden Runden Betadin- und 70%igem Ethanoltupfer.
   7. Befestigen Sie die Nadel an einer 1-ml-Spritze und richten Sie die Nadelspitze parallel zur Schienbeinachse auf die Injektionsstelle. Führen Sie die Nadel perkutan ein, um ein Loch durch die Tibiaplattform in Richtung des distalen Endes der Tibia zu bohren.
   8. Laden Sie die zuvor auf Eis gelegte Osteosarkom-Zellsuspension in eine Mikrovolumenspritze und ersetzen Sie die 1-ml-Spritze in der Tibia durch die mit Osteosarkomzellen beladene Mikrovolumenspritze. Injizieren Sie langsam etwa 10 μl (1 x 10⁷ Zellen/ml) Osteosarkom-Zellsuspension in die Tibia jeder athymischen Maus.
   9. Entfernen Sie die Mikrovolumenspritze von der Injektionsstelle und drücken Sie die Injektionsstelle mit dem Wattestäbchen etwa 30 s lang. Setzen Sie die Maus wieder in einen sauberen Käfig und beobachten Sie ihre Erholung 10 Minuten lang.

5. Zubereitung der Abkochformel der traditionellen chinesischen Medizin für die Sonde (Abbildung 2)

1. Berechnen Sie die Dosierung gemäß Schritt 2.
2. Weichen Sie alle Heilkräuter zum Abkochen, mit Ausnahme des teuren Krauts Ginseng, 30 Minuten lang in Trinkwasser mit einer Höhe von 3 cm über der Arzneimitteloberfläche ein und führen Sie dann die Abkochung 2x wie unten beschrieben durch.
3. Führen Sie den ersten Sud durch, indem Sie ihn über einem starken Feuer zum Kochen bringen und dann 15-25 Minuten lang über einem milden Feuer erhitzen. Mildes Feuer bezieht sich auf eine Hitze mit geringer Leistung mit Temperaturen zwischen 80 °C und 100 °C, während sich starkes Feuer auf eine Hochleistungshitze bezieht, die typischerweise zwischen 200 °C und 300 °C liegt.
4. Gießen Sie die Abkochflüssigkeit in einen Behälter.
5. Führen Sie den zweiten Sud durch, indem Sie die Heilkräuter in Trinkwasser mit einem Volumen erhitzen, das gerade ausreicht, um die Arzneimitteloberfläche einzutauchen, um es über einem starken Feuer zum Kochen zu bringen, und dann 15-25 Minuten lang über einem milden Feuer erhitzen.
6. Gießen Sie die Abkochflüssigkeit in denselben Behälter wie in Schritt 5.4.
7. 42 g Ginseng separat einweichen und abkochen, mit Trinkwasser, das 3 cm höher als die Arzneimitteloberfläche ist, da es teuer ist.
8. Führen Sie den ersten Sud des eingeweichten Ginsengs durch, indem Sie ihn 60 Minuten lang über starkem Feuer erhitzen.
   Gießen Sie die Abkochflüssigkeit in denselben Behälter wie in Schritt 5.4.
9. Führen Sie den zweiten Sud von Ginseng in Trinkwasser mit einem Volumen durch, das gerade ausreicht, um die Arzneimitteloberfläche einzutauchen, indem Sie es 40 Minuten lang über einem milden Feuer erhitzen. Gießen Sie die Abkochflüssigkeit in denselben Behälter wie in Schritt 5.4.
   HINWEIS: Die zum Abkochen verwendeten Behälter sollten chemisch stabil sein, wie z. B. Aufläufe (die in der klinischen Praxis am häufigsten verwendeten), Keramik, Glas und Edelstahl, um mögliche chemische Reaktionen mit den Arzneimitteln zu vermeiden. Die gesamte Abkochflüssigkeit, die aus verschiedenen Schritten gewonnen wird, muss in denselben Behälter gegeben werden.
10. Mischen und filtern Sie die Abkochflüssigkeit mit drei Schichten Gaze, die mit Gummibändern an der Öffnung eines Messbechers befestigt sind.
11. Kochen Sie den gefilterten Sud bei starkem Feuer in einem Topf, wechseln Sie dann zu mildem Feuer und behalten Sie das milde Feuer bei, bis die Zielkonzentration erreicht ist (ein Endvolumen von 84 ml mit einer Endkonzentration von 1,5 g/ml).
12. Bereiten Sie 21 ml Aliquote des konzentrierten Suds entsprechend der für die intragastrische Verabreichung erforderlichen Dosis für 1 Woche vor und lagern Sie die Aliquote im Kühlschrank bei -20 °C.

6. Sondenverabreichung bei Mäusen mit einem Sondengerät

1. Legen Sie die Maus auf die Oberfläche des Mauskäfigs oder eine andere rauere Oberfläche.
2. Fassen Sie den Schwanz der Maus mit Daumen und Zeigefinger der rechten Hand. Fassen Sie dann den Hals der Maus mit Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger der linken Hand.
3. Halten Sie den Mausschwanz mit den anderen beiden Fingern der linken Hand fest, um Kopf, Hals und Körper der Maus in einer geraden Linie zu bilden.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Maus während des gesamten Greifvorgangs entspannt zu halten. Wenn die Maus weiterhin Schwierigkeiten hat, sich zu bewegen, sollte der Greifvorgang durchgeführt werden, bis die Maus entspannt ist.
4. Halten Sie das Sondengerät in die rechte Hand und laden Sie 200 μl Abkochformel für eine Maus mit 20 g Körpergewicht (100 μl Abkochformel/10 g Körpergewicht der Maus).
5. Führen Sie die Sondennadel aus dem Eckwinkel in den Mund ein und drücken Sie die Zunge gegen den Oberkiefer der Maus.
6. Halten Sie den Mauskörper in die gleiche Richtung und schieben Sie die Sondennadel vorsichtig entlang der Speiseröhre in Richtung Magen, bis etwa 10 mm der Sondennadel außen bleiben.
   HINWEIS: Es gibt ein hohles Gefühl, wenn die Sondennadel in die Speiseröhre eindringt. Die Länge der in die Maus eingeführten Sondennadel sollte bis zur Oberseite des Brustbeins gemessen werden. Die Gesamtlänge der Sondennadel beträgt 60 mm (Abbildung 3), daher sollten etwa 50 mm der Sondennadel in den Körper der Maus eingeführt werden, bevor die Abkochformel in den Magen der Maus injiziert wird.
7. Injizieren Sie die Abkochformel in den Magen der Maus. Wenn Sie auf einen Widerstand stoßen oder Flüssigkeit aus dem Mundwinkel austritt, bedeutet dies eine Fehlplatzierung der Sondennadel, die vermieden werden muss. Außerdem muss die Einspritzgeschwindigkeit verlangsamt werden, wenn die Abkochformel dick ist.
8. Lassen Sie die Maus los und beobachten Sie sie 10 Minuten lang. Die Sonde ist erfolgreich, wenn keine Atemanomalie beobachtet wird und die Maus in den Käfig zurückgebracht wird (Abbildung 4).

7. Ablauf der Behandlung

1. Um die therapeutische Wirksamkeit der Yiqi Jiedu-Abkochung zu untersuchen, richten Sie eine Kontrollgruppe und eine Yiqi Jiedu-Abkochgruppe ein. Verabreichen Sie Mäusen in der Kontrollgruppe 28 Tage lang einmal täglich physiologische Kochsalzlösung. Verabreichen Sie Mäusen in der Yiqi Jiedu-Abkochgruppe den Yiqi Jiedu-Sud 28 Tage lang einmal täglich.

8. Nebenwirkungen

1. Beobachten Sie den Status der Mäuse nach dem Zurücksetzen in den Käfig genau, einschließlich Gewichtsverlust und vermindertem mentalen Zustand aufgrund der Unfähigkeit der Nahrung, in den Magen zu gelangen.
2. Mäuse haben Atembeschwerden und Kurzatmigkeit aufgrund einer durch die Nahrung verursachten Trachealobstruktion und husten, um die Luftröhre zu reinigen. Wenn eines dieser Symptome während der Sonde beobachtet wird, stoppen Sie sofort die Sonde und euthanasieren Sie die Mäuse.

Ergebnisse

Die hemmende Wirkung der Yiqi Jiedu-Abkochung auf das Wachstum von Osteosarkomen in vivo wurde in einem intratibialen Xenotransplantat-Osteosarkom-Mausmodell bestimmt, das durch Injektion der 143B-Osteosarkomzellen in die Tibia von athymischen Mäusen hergestellt wurde. Der Yiqi Jiedu-Sud wurde den Mäusen der Yiqi Jiedu-Abkochungsgruppe ab dem zweiten Tag der 143B-Injektion 28 Tage lang per Sonde verabreicht. Den Mäusen in der Kontrollgruppe wurde physiologische Kochsalzlösung verabreicht. Alle Mäuse wurden ...

Diskussion

Die klinische Wirksamkeit der in der traditionellen chinesischen Medizin verschriebenen Kräuter hängt weitgehend mit der verabreichten Dosis und Darreichungsform zusammen; Daher sind die Etablierung einer standardisierten Abkochstrategie und eines qualifizierten Verabreichungsprozesses in der klinischen Praxis sowie zur Verbesserung der Zuverlässigkeit experimenteller Ergebnisse erforderlich.

In dieser Studie haben wir zunächst eine detaillierte Strategie für das standardisierte Abkochen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells