骨肉腫モデルマウスにおける漢方薬の煎じ薬の強制経口投与戦略

要約

プロトコルは例として骨肉腫のマウス モデルのYiqi Jieduの煎じ薬の煎じ薬の煎じ薬の方式および強制経口の技術の詳しい標準化プロセスを提供する。動物保護について説明し、研究データの信頼性を向上させ、in vivoでの煎じ薬処方の治療効果と分子メカニズムを調査するための効果的な戦略を提供します。

要約

煎じ薬は、伝統的な漢方薬で最も一般的に使用されている剤形であり、経口投与によって何千年もの間臨床診療に適用されており、患者の特定の症候群に基づいて迅速な効果、吸収の容易さ、および個別化された治療を特徴としています。煎じ薬の品質は、伝統的な漢方薬の臨床効果に直接関係しています。したがって、主観的要因によって引き起こされる煎じ薬の品質の違いを避けるために、煎じ薬処方の標準化プロセスが重要です。一方、臨床実験の実施には限界があるため、マウスなどのヒトの病気を媒介とする小動物は、漢方薬の煎じ薬を含むさまざまな介入の治療効果と包括的なメカニズムを調査するために医学研究によく使用されます。したがって、経口投与法として重要な経口投与法として、食道の損傷や薬剤のこぼれを防ぐために熟練した強制経口投与技術が特に重要であり、これにより、各モデル動物に均等な量の薬が投与され、正確な実験結果が得られます。さらに、煎じ薬調製剤の標準化された方法と熟練した強制経口投与戦略は、動物福祉を保護し、使用される動物の数を最小限に抑えるために必要です。ここでは、骨肉腫マウスモデルにおけるYiqi Jiedu煎じ薬を用いた煎じ薬処方と強制経口投与技術の詳細な標準化プロセスを報告しました。有効性は腫瘍体積によって評価された。従ってこのプロトコルは動物保護を最大にし、研究データの信頼性を改善し、生体 内の従来の漢方薬のための煎じ薬の方式の治療効果そして分子メカニズムを将来調査するための有効な作戦を提供する。

概要

煎じ薬は、伝統的な漢方薬と液体の薬の最も一般的に使用される剤形です^1,2。伝統的な漢方薬の煎じ薬は、ハーブを水に浸した後、水で煎じ、濾過してかすを捨てることによって処理されます。

煎じ薬の処方は、特に伝統的な中国医学における証拠に基づく治療の特徴に沿って、臨床的必要性に基づいて個別化できるため、経口投与によるこの剤形は、何千年もの間臨床診療に適用され、具体的でかけがえのない利点があります^3,4.煎じ薬の品質は、臨床効果に直接関係しています。したがって、煎じ薬処方は、有効成分が最大限に抽出され^{、保護されるように}、標準化された煎じ薬法の原則に基づいて調製する必要があります3。一方、煎じ薬対応薬は、臨床診療で使用される生の漢方薬の主な形態です。処方された煎じ薬の品質基準と製造方法は、中国薬局方²の規定に準拠している必要があります。さらに、処方された煎じ薬は、冷たい飲料水に少なくとも30分間浸してから^{、加熱して}特別な医薬品ポットで煎じる必要があります5。研究によると、ほとんどの有効成分は2回煎じることによって抽出でき、医療機関における伝統的な漢方薬の煎じ薬室の管理に関する実践規範も、煎じ薬^を2回行うように規定しています^4,6,7。硬い食感のものや強壮剤などの特別な漢方薬が処方されている場合は、煎じ薬時間を延長することをお勧めします。処方された煎じ薬が浸されている容器から始めて、煎じ薬製剤と直接接触する煎じ薬器具および貯蔵容器は、化学的に安定しており、キャセロール、セラミック、ガラス、ステンレス鋼などの蓋が付いている必要があります。ただし、アルミニウムや通常のプラスチック製品は使用しないでくださいが、鉄やその他の腐食性器具は、治療効果を低下させ、有害な影響を引き起こす可能性のある化学反応を避けるために禁止する必要があります^4,6,7。

臨床実験の実施には限界があるため、マウスなどのヒトの病気を媒介する小動物は、伝統的な漢方薬の煎じ薬を含むさまざまな介入の治療効果と包括的なメカニズムを調査するために医学研究でよく使用されます^8,9;ただし、人間とは異なり、煎じ薬の処方は毎日調製し、混合し、臨床診療で1日2回新たに投与する必要があります。動物は自発的に薬を必要な用量で時間通りに服用することができず、現在、漢方薬に関連する動物実験のほとんどは、煎じ薬の強制経口投与です。in vivo動物実験に使用される煎じ薬式は、事前に調製し、分注し、-20°Cで保存し^{、使用直前に}解凍する必要があります^3,4,10。さらに、標準以下の動物の固定化と強制経口注射針の操作は、不必要な怪我や否定的な感情のリスクを高めます。したがって、経口薬物送達の重要な方法として、食道損傷や薬物のこぼれの可能性を回避し、各モデル動物に同量の処方された漢方薬を投与して正確な実験結果を得るために、熟練した強制経口投与技術が特に重要です。ここでは、漢方薬の煎じ薬の強制経口投与プロトコルを提供します。

プロトコル

このプロトコルはサンプルとしてYiqi Jieduの煎じ薬の使用によって骨肉腫モデルマウスの詳しい強制経口の技術を記述する。この実験では、生後4週間の雄の胸腺マウス(BALB/cヌード)を使用し、上海中医薬大学実験動物センターのSPFグレードの飼育室で飼育しました。すべての動物実験は、上海中医薬大学動物管理委員会によって承認され、実験動物倫理綱領(動物倫理承認番号:PZSHUTCM2304060007)に準拠し、実験動物に関する国際的な要件に厳密に従って実施されました。

1. 素材

1. 漢方薬(高麗人参42g、 Hedyotis diffusa 52.5g、有刺鉄線スカルキャップハーブ31.5g)、1mLシリンジ、12G/55mm肘強制経口注射針を入手します(図1)。

2.投与量の決定

1. 標準体重60kgの成人の1日投与量は、高麗人参12g、 Hedyotis diffusa 15g、とげのある頭蓋骨ハーブ9gで、合計36gの煎じ薬、つまり0.6gの煎じ薬/ kg体重です。体表面積¹¹によると、標準体重60kgの成体と標準体重25gのマウスの等価用量12倍、低用量6倍、高用量24倍、および我々の予備データを参照して、本研究のマウスにYiqi Jiedu煎じ薬の20倍の用量比を使用し、 したがって、マウスの投与量は12gの煎じ薬/kg体重であった。
2. 次の式を使用して、各マウスの投与量を計算します。
   マウスの投与量(スタンド体重)=成人の投与量(スタンド体重)×20(指定等価線量比)。
   各マウスの1日の投与量は、200 μLで0.3 g [(12 gの煎じ薬/ 1000 g体重)x 25 g体重]で、最終濃度は1.5 g / mLです。.
3. Yiqi Jiedu 煎じ薬群のマウス (n=7) の煎じ薬の総量を 28 日間強制経口投与して 58.8 g と計算します。これを 39.2 mL に濃縮し、最終濃度 1.5 g/mL にします。
4. 煎じ薬および強制経口投与段階での薬物損失の可能性を考慮し、計算の便宜上、合計126 g(高麗人参42 g、 Hedyotis diffusa 52.5 g、とげのある頭蓋骨ハーブ31.5 g)の煎じ薬を準備し、84 mLの最終容量に濃縮します。

3. 細胞源と培養

1. ATCC細胞バンクからヒト由来の143B骨肉腫細胞を購入します。
2. 10 cmの細胞培養皿に、10% FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLのストレプトマイシンを含む10 mLのMEM培地に1 x 10⁶ 143B細胞を播種します。
3. 143B細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cで細胞が80%〜90%コンフルエントになるまで培養します。

4. モデリング手法

1. 80%コンフルエント培養した143B細胞を回収し、6 mLの10%血清含有MEM培地に再懸濁し、基底膜マトリックスゲルと体積比1:1で混合して、最終濃度が1 x 10⁷ 細胞/mLの細胞懸濁液を作製します。
2. 10μLの細胞懸濁液を各胸腺マウスの左脛骨に注入して、以前の出版物¹²に記載されているように、in situ異種移植骨肉腫マウスモデルを確立します。手順の概要は次のとおりです。
   1. 細胞をPBSで2回洗浄します。1.5 mLの0.25%トリプシンで細胞を3分間トリプシン処理します。6 mL の 10% 血清含有 MEM 培地を添加します。細胞を15 mLの遠心チューブに集めます。
   2. 20 μL の細胞懸濁液を細胞計数プレートのチャンバーに吸引し、自動セルカウンターを使用して細胞濃度を計算します。細胞を室温で800 x g で5分間遠心分離します。
   3. 上清をピペットで廃棄し、細胞ペレットを8.5 mg/mLの基底膜マトリックスに再懸濁し、氷上に置いてください。
   4. マウスを2%イソフルランと98%の酸素(酸素流量、2 L / min)に曝露して麻酔をかけます。麻酔中の乾燥を防ぐために、少量の獣医用軟膏を目に塗ります。
   5. 換気の良い場所で手順全体を実行してください。骨肉腫細胞注射の前に、足をそっと触れて、各マウスが深い麻酔下にあることを確認してください。マウスにまだ Twitch や Jerk などの応答がある場合。マウスにけいれんやジャークなどの反応が残っている場合は、これらの反応が消えるまで、より長い時間待ちます。
   6. マウスを仰臥位に置きます。親指と人差し指でマウスの足首を持ち、ベタジンと70%エタノール綿棒を交互に3回交互に投与して脛骨の注射部位を消毒します。
   7. 針を1mLのシリンジに取り付け、針先を脛骨の軸に平行な注射部位に向けます。針を経皮的に挿入して、脛骨プラットフォームを貫通して脛骨の遠位端に向かって穴を開けます。
   8. 以前に氷上に置いた骨肉腫細胞懸濁液をマイクロボリュームシリンジにロードし、脛骨内の1 mLシリンジを骨肉腫細胞ロードマイクロボリュームシリンジと交換します。.約 10 μL (1 x 10⁷ cells/mL) の骨肉腫細胞懸濁液を各胸腺マウスの脛骨にゆっくりと注入します。
   9. 微量シリンジを注射部位から取り外し、綿棒で注射部位を約30秒間押します。マウスを清潔なケージに戻し、10分間回復を観察します。

5.強制経口投与のための漢方薬煎じ薬処方の調製(図2)

1. ステップ2に従って投与量を計算します。
2. 高価なハーブの高麗人参を除くすべての煎じ薬草を、薬の表面より3 cm高いレベルの飲料水に30分間浸し、次に以下に説明するように煎じ薬を2回実行します。
3. 強い火で沸騰するまで加熱し、次に穏やかな火で15〜25分間加熱することにより、最初の煎じ薬を実行します。軽度の火とは、通常80°Cから100°Cの範囲の温度の低電力熱を指し、強火は通常200°Cから300°Cの範囲の高出力熱を指します。
4. 煎じ薬液を1つの容器に注ぎます。
5. 薬草を飲料水で加熱し、薬の表面を沈めるのに十分な量で強い火で沸騰させ、穏やかな火で15〜25分間加熱することにより、2回目の煎じ薬を実行します。
6. 手順5.4と同じ容器に煎じ薬液を注ぎます。
7. 高麗人参42gを別々に浸して煎じ、薬の表面より3cm高い飲料水で、高価です。
8. 浸した高麗人参を強い火で60分間加熱して、最初の煎じ薬を実行します。
   手順5.4と同じ容器に煎じ薬液を注ぎます。
9. 中火で40分間加熱することにより、薬の表面を水没させるのに十分な量の飲料水で高麗人参の2回目の煎じ薬を実行します。手順5.4と同じ容器に煎じ薬液を注ぎます。
   注意: 煎じ薬に使用される容器は、医薬品との化学反応の可能性を避けるために、キャセロール(臨床診療で最も一般的に使用される)、セラミック、ガラス、ステンレス鋼など、化学的に安定している必要があります。.異なるステップから得られたすべての煎じ薬液は、同じ容器に入れなければなりません。
10. 計量カップの口に輪ゴムで固定された3層のガーゼを使用して、煎じ薬液を混合してろ過します。
11. ろ過した煎じ薬を鍋の強い火で沸騰させ、次に穏やかな火に変え、目標濃度(最終濃度1.5 g / mLの最終濃度で最終容量84 mL)に達するまで弱火を保ちます。
12. 1週間の胃内投与に必要な用量に従って、濃縮煎じ薬のアリコート21mLを調製し、アリコートを-20°Cの冷蔵庫に保管します。

6. 強制経口避妊装置を用いたマウスへの強制経口投与

1. マウスケージの表面またはその他の粗い表面にマウスを置きます。
2. 右手の親指と人差し指でマウスの尻尾をつかみます。次に、左手の親指、人差し指、中指でマウスの首をつかみます。
3. 左手の残りの2本の指でマウスの尻尾を持ち、マウスの頭、首、体を一直線にします。
   注意: つかむプロセス全体を通して、マウスをリラックスさせてください。マウスが動きにくい場合は、マウスがリラックスするまで把持プロセスを実行する必要があります。
4. 強制経口避妊薬を右手に持ち、体重20gのマウスに200μLの煎じ薬を装填します(100μLの煎じ薬調製剤/マウスの体重10g)。
5. 強制経口注射針を口の角から挿入し、舌をマウスの上顎に押し付けます。
6. マウスの体を同じ方向に保ち、強制経口注射針が約10mm外側に残るまで、食道に沿って胃に向かってゆっくりと押します。
   注:強制経口注射針が食道に入ると空洞感があります。マウスに挿入された強制経口注射針の長さは、胸骨の上部まで測定する必要があります。.強制経口注射針の全長は60mm(図3)であるため、煎じ薬をマウスの胃に注入する前に、約50mmの強制経口注射針をマウスの体内に挿入する必要があります。
7. 煎じ薬の処方をマウスの胃に注射します。抵抗にぶつかったり、口角から液体が出たりすると、強制経口注射針の位置がずれるため、避けなければなりません。さらに、煎じ薬式が厚い場合は、注入速度を遅くする必要があります。
8. マウスを放し、10分間観察します。強制経口投与は、呼吸異常が認められず、マウスをケージに戻せば成功です(図4)。

7.治療方針

1. Yiqi Jiedu 煎じ薬の治療効果を調べるには、対照群と Yiqi Jiedu 煎じ薬群を設定します。対照群のマウスには、生理食塩水を1日1回28日間投与する。Yiqi Jiedu煎じ薬群のマウスには、Yiqi Jiedu煎じ薬を1日1回28日間投与します。

8.副作用

1. ケージに戻された後のマウスの状態を注意深く観察し、体重減少や餌が胃に入らないことによる精神状態の低下などを観察します。
2. マウスは、食物による気管閉塞により呼吸困難や息切れを経験し、気管をきれいにしようとして咳をします。強制経口投与中にこれらの症状のいずれかが観察された場合は、直ちに強制経口投与を中止し、マウスを安楽死させてください。

結果

in vivoでの骨肉腫の増殖に対するYiqi Jiedu煎じ薬の阻害効果は、143B骨肉腫細胞を胸腺マウスの脛骨に注入することによって調製された脛骨内異種移植骨肉腫マウスモデルで決定されました。Yiqi Jiedu煎じ薬は、Yiqi Jiedu煎じ薬群のマウスに、143B注射の2日目から28日間強制経口投与した。生理食塩水を対照群のマウスに投与した。すべてのマウスを28日後に安楽死させた。結果は、Yiqi Jiedu煎?...

ディスカッション

伝統的な漢方薬で処方されたハーブの臨床効果は、投与量と剤形に大きく関連しています。したがって、標準化された煎じ薬戦略および熟練した投与プロセスの確立は、臨床診療において、ならびに実験結果の信頼性を向上させるためにも必要である。

この研究では、まず、伝統的な漢方薬の臨床診療で使用される漢方薬の標準化された煎じ薬の詳細な戦略を提供し、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells