Стратегия отвара традиционной китайской медицины у модельных мышей с остеосаркомой

Резюме

Протокол содержит детальный процесс стандартизации формулы отвара и техники зондирования на примере отвара Yiqi Jiedu на мышиной модели остеосаркомы. В нем описывается защита животных и повышается надежность данных исследований, предлагаются эффективные стратегии для изучения терапевтической эффективности и молекулярных механизмов формул отваров in vivo.

Аннотация

Формула отвара является наиболее часто используемой лекарственной формой в традиционной китайской медицине и применяется в клинической практике на протяжении тысячелетий путем трансорального введения, которое характеризуется быстрым эффектом, легким всасыванием и индивидуальным лечением, основанным на конкретных синдромах пациентов. Качество формулы отвара напрямую отвечает за клиническую эффективность традиционной китайской медицины; Поэтому процесс стандартизации формулы отвара важен, чтобы избежать различий в качестве отвара, вызванных субъективными факторами. Между тем, из-за ограничений проведения клинических экспериментов мелкие животные-переносчики болезней человека, такие как мыши, часто используются в медицинских исследованиях для изучения терапевтической эффективности и комплексных механизмов различных вмешательств, в том числе формулы отвара для традиционной китайской медицины. Следовательно, в качестве важного метода трансорального введения, квалифицированная техника зондирования особенно важна для предотвращения потенциального повреждения пищевода и разлива лекарства, что обеспечит равное количество лекарства, вводимого каждому модельному животному, что приведет к точным экспериментальным результатам. Кроме того, стандартизированный метод приготовления смеси отвара и квалифицированная стратегия зондирования необходимы для защиты благополучия животных и минимизации количества используемых животных. Здесь мы сообщили о подробном процессе стандартизации формулы отвара и техники зондирования на примере отвара Yiqi Jiedu на мышиной модели остеосаркомы. Эффективность оценивали по объему опухоли. Этот протокол обеспечит максимальную защиту животных и повысит надежность данных исследований, тем самым обеспечивая эффективные стратегии для будущих исследований терапевтической эффективности и молекулярных механизмов формулы отвара для традиционной китайской медицины in vivo.

Введение

Отварная формула является наиболее часто используемой лекарственной формой традиционной китайской медицины и жидкими лекарственными препаратами ^1,2. Формула отвара традиционной китайской медицины обрабатывается путем отваривания трав в воде после замачивания с последующей процеживанием, чтобы избавиться от мухи.

Поскольку формула отвара может быть индивидуализирована в зависимости от клинических потребностей, особенно в соответствии с характеристиками доказательной медицины в традиционной китайской медицине, эта лекарственная форма путем трансорального введения применяется в клинической практике на протяжении тысячелетий с конкретными и незаменимыми преимуществами ^3,4. Качество формулы отвара напрямую связано с клинической эффективностью. Поэтому формула отвара должна быть приготовлена на основе принципов стандартизированных методов отвара, чтобы обеспечить максимальную экстракцию и защиту активных ингредиентов³. Между тем, готовые к употреблению лекарства являются основной формой сырых китайских трав, используемых в клинической практике; стандарты качества и методы производства рецептурных лекарственных средств, готовых к приготовлению отваров, должны соответствовать положениям Китайской фармакопеи². Кроме того, назначенные лекарственные средства, готовые к приготовлению отвара, должны быть замочены в холодной питьевой воде не менее чем на 30 мин, а затем отварены в специальной аптечной кастрюле путем нагревания⁵. Исследования показали, что большинство активных ингредиентов можно извлечь путем отваривания в течение двух раз, а Свод правил применения отваров традиционной китайской медицины в медицинских учреждениях также предписывает делать отвар дважды ^4,6,7. Если назначаются специальные китайские травы, например, с твердой консистенцией или тоники, время приема отвара рекомендуется продлить. Посуда для отвара и емкости для хранения, которые непосредственно контактируют с рецептурой отвара, начиная с емкости, в которой замачиваются назначенные лекарства, должны быть химически стойкими и иметь крышки, такие как запеканки, керамика, стекло и нержавеющая сталь. Однако не следует использовать алюминиевые и обычные пластиковые изделия, а железо и другую едкую посуду следует запретить, чтобы избежать возможных химических реакций, которые снизят терапевтическую эффективность и даже окажут вредное воздействие ^4,6,7.

Из-за ограничений в проведении клинических экспериментов мелкие животные, являющиеся переносчиками болезней человека, такие как мыши, часто используются в медицинских исследованиях для изучения терапевтической эффективности и комплексных механизмов различных вмешательств, включая формулу отвара традиционной китайской медицины ^8,9; Однако, в отличие от людей, в клинической практике отвары следует готовить каждый день, смешивать вместе и принимать 2 раза в день. Животные не могут добровольно принимать лекарства вовремя с необходимой дозировкой, и большинство экспериментов на животных, связанных с традиционной китайской медициной, в настоящее время представляют собой пероральное введение отваров через зонд. Формулы отваров, используемые для экспериментов на животных in vivo, должны быть приготовлены заранее, алицитированы, хранятся при -20 °C и разморожены непосредственно перед использованием ^3,4,10. Кроме того, некачественная иммобилизация животных и манипуляции с иглами зонда увеличивают риск ненужных травм и негативных эмоций. Таким образом, как важный метод трансоральной доставки лекарств, квалифицированная техника зондирования особенно важна для предотвращения возможного повреждения пищевода и разлива лекарства, тем самым гарантируя, что каждое модельное животное получит равное количество назначенных растительных лекарств для достижения точных экспериментальных результатов. Здесь мы приводим протокол зондирования для формулы отвара традиционной китайской медицины.

протокол

Этот протокол описывает детальную технику зондирования у мышей модели остеосаркомы с использованием отвара Yiqi Jiedu в качестве образца. Четырехнедельные самцы атимических мышей (BALB/c nude) были использованы в этом эксперименте и содержались в комнате для разведения SPF-класса Центра лабораторных животных в Шанхайском университете традиционной китайской медицины. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по управлению животными Шанхайского университета традиционной китайской медицины, соответствовали Кодексу этики для лабораторных животных (Animal Ethics Approval Number: PZSHUTCM2304060007) и проводились в строгом соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к лабораторным животным.

1. Материалы

1. Приобретите следующие материалы: китайские травы (женьшень 42 г, Hedyotis diffusa 52,5 г, трава колючей тюбетейки 31,5 г), шприц объемом 1 мл и игла для локтевого зонда 12 г/55 мм (рис. 1).

2. Определение дозировки

1. Рассчитайте суточную дозировку следующим образом: суточная доза для взрослых со стандартной массой тела 60 кг составляет женьшень 12 г, Hedyotis diffusa 15 г и трава шлемника колючего 9 г, всего 36 г готового отвара лекарства, то есть 0,6 г готовых отваров лекарств на кг массы тела. Ссылаясь на 12 раз для эквивалентной дозы, 6 раз для низкой дозы и 24 раза для высокой дозы между взрослыми особями со стандартной массой тела 60 кг и мышами со стандартной массой тела 25 г в соответствии с площадью поверхности тела¹¹, а также наши предварительные данные, используйте 20-кратное соотношение доз отвара Ици Цзеду для мышей в настоящем исследовании, Таким образом, дозировка для мышей составляла 12 г готовых отваров лекарств на кг массы тела.
2. Рассчитайте дозировку для каждой мыши по формуле:
   Дозировка для мыши (масса тела стенда) = дозировка для взрослой особи (масса тела стенда) x 20 (назначенное эквивалентное соотношение доз).
   Суточная доза для каждой мыши составляет 0,3 г [(12 г готовых отваров лекарств на 1000 г массы тела) x 25 г массы тела] в 200 мкл с конечной концентрацией 1,5 г/мл.
3. Рассчитайте общее количество готовых к употреблению отваров лекарств для мышей (n=7) в группе отваров Yiqi Jiedu с введением через зонд в течение 28 дней, чтобы оно составило 58,8 г. Концентрируйте его до 39,2 мл, чтобы получить конечную концентрацию 1,5 г/мл.
4. Учитывая возможную потерю препарата на этапах отвара и зондирования, и для удобства расчета, приготовьте в общей сложности 126 г (женьшень 42 г, Hedyotis diffusa 52,5 г, трава шлемника колючего 31,5 г) готового к отвару лекарства, концентрируйте в конечный объем 84 мл.

3. Клеточный источник и культура

1. Приобретите клетки остеосаркомы 143B человеческого происхождения из банка клеток ATCC.
2. Высевают 1 x 10⁶ клеток 143B в 10 мл МЭМ-среды, содержащей 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в 10-сантиметровой чашке для клеточной культуры.
3. Культивируйте клетки 143B при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 до тех пор, пока клетки не будут слияться на 80%-90%.

4. Методы моделирования

1. Собирают 80% конфлюентные культивируемые клетки 143B, ресуспендируют в 6 мл 10% сывороточной МЭМ-среды и смешивают с матричным гелем базальной мембраны в объемном соотношении 1:1 для получения клеточной суспензии с конечной концентрацией 1 x 10⁷ клеток/мл.
2. Введите 10 мкл клеточной суспензии в левую большеберцовую кость каждой мыши, чтобы создать модель мыши с ксенотрансплантатом остеосаркомы in situ , как описано в нашей предыдущей публикации¹². Вкратце шаги следующие.
   1. Промойте клетки 2 раза с помощью PBS. Трипсинизировать клетки 1,5 мл 0,25% трипсина в течение 3 мин. Добавьте 6 мл 10% МЭМ-среды, содержащей сыворотку. Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   2. Аспирируйте 20 мкл клеточной суспензии в камеру подсчета клеток и рассчитайте концентрацию клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Центрифугируйте клетки при 800 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клеточные гранулы в матрице базальной мембраны 8,5 мг/мл и поместите их на лед.
   4. Обезболивайте мышей, подвергая их воздействию 2% изофлурана и 98% кислорода (скорость потока кислорода 2 л/мин). Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
   5. Всю процедуру выполняйте в хорошо проветриваемом помещении. Перед инъекцией клеток остеосаркомы убедитесь, что каждая мышь находится под глубоким наркозом, осторожно прикасаясь к стопе; Если мышь по-прежнему реагирует, например дергается или дергается. Подождите более длительное время, если мышь все еще реагирует, например подергивается или дергается, пока эти реакции не исчезнут.
   6. Поместите мышь в положение лежа на спине. Возьмитесь за лодыжку мыши большим и указательным пальцами и продезинфицируйте место инъекции большеберцовой кости тремя чередующимися циклами тампона бетадина и 70% этанола.
   7. Прикрепите иглу к шприцу объемом 1 мл и направьте кончик иглы к месту инъекции параллельно оси большеберцовой кости. Чрескожно введите иглу, чтобы просверлить отверстие через платформу большеберцовой кости по направлению к дистальному концу большеберцовой кости.
   8. Загрузите суспензию клеток остеосаркомы, предварительно помещенную на лед, в шприц микрообъема и замените шприц объемом 1 мл в большеберцовой кости шприцем микрообъема, загруженным клетками остеосаркомы. Медленно введите примерно 10 мкл (1 x 10,⁷ клеток/мл) клеточной суспензии остеосаркомы в большеберцовую кость каждой мыши.
   9. Извлеките шприц микрообъема из места инъекции и прижмите место инъекции ватным тампоном примерно на 30 с. Поместите мышь обратно в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением в течение 10 минут.

5. Приготовление отвара традиционной китайской медицины для зонда (рисунок 2)

1. Рассчитайте дозировку в соответствии с шагом 2.
2. Замочите все лекарственные травы для отвара, кроме дорогостоящей травы женьшеня, в питьевой воде уровнем на 3 см выше поверхности лекарства на 30 минут, а затем выполните отвар 2 раза, как описано ниже.
3. Первый отвар выполняют, нагревая до кипения на сильном огне, а затем нагревая в течение 15-25 мин на слабом огне. Слабый огонь относится к жаре малой мощности с температурой от 80 °C до 100 °C, в то время как сильный огонь относится к жаре высокой мощности, обычно от 200 °C до 300 °C.
4. Перелейте отварную жидкость в одну емкость.
5. Второй отвар выполняют, нагревая лекарственные травы в питьевой воде объемом, достаточным для погружения поверхности лекарства, до кипения на сильном огне, а затем нагревая в течение 15-25 минут на слабом огне.
6. Перелейте отварную жидкость в ту же емкость, что и в шаге 5.4.
7. Замочите и отварите 42 г женьшеня отдельно, запивая питьевой водой на 3 см выше поверхности лекарства, так как это дорого.
8. Первый отвар замоченного женьшеня выполняют, нагревая его на сильном огне в течение 60 мин.
   Перелейте отварную жидкость в ту же емкость, что и в шаге 5.4.
9. Выполните второе приготовление отвара женьшеня в питьевой воде объемом, достаточным для погружения поверхности лекарства, нагревая на слабом огне в течение 40 минут. Перелейте отварную жидкость в ту же емкость, что и в шаге 5.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Емкости, используемые для отвара, должны быть химически стабильными, такими как запеканки (наиболее часто используемые в клинической практике), керамика, стекло и нержавеющая сталь, чтобы избежать возможных химических реакций с лекарственными веществами. Всю отварную жидкость, полученную разными ступенями, необходимо поместить в одну емкость.
10. Перемешайте и процедите отварную жидкость с помощью трех слоев марли, закрепленной у горлышка мерного стаканчика резинками.
11. Процеженный отвар прокипятить на сильном огне в кастрюле, затем переключить на слабый огонь и поддерживать слабый огонь до достижения целевой концентрации (конечный объем 84 мл с конечной концентрацией 1,5 г/мл).
12. Приготовьте 21 мл аликвоты концентрированного отвара в соответствии с дозой, необходимой для внутрижелудочного введения, в течение 1 недели и храните аликвоты в холодильнике при температуре -20 °C.

6. Введение зонда у мышей с помощью зондового устройства

1. Поместите мышь на поверхность клетки для мышей или другую более шероховатую поверхность.
2. Возьмитесь за хвост мыши большим и указательным пальцами правой руки. Затем возьмитесь за шею мыши большим, указательным и средним пальцами левой руки.
3. Удерживайте хвост мыши двумя другими пальцами левой руки, чтобы голова, шея и тело мыши образовали прямую линию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышь расслаблена в течение всего процесса захвата. Если мышь продолжает испытывать трудности с движением, процесс захвата следует выполнять до тех пор, пока мышь не расслабится.
4. Возьмите зонд в правую руку и загрузите 200 мкл отварной смеси для мыши с массой тела 20 г (100 мкл формулы отвара/10 г массы тела мыши).
5. Вставьте иглу зонда в рот от угла и прижмите язык к верхней челюсти мыши.
6. Держите тело мыши в том же направлении и осторожно проталкивайте иглу зонда к желудку вдоль пищевода, пока снаружи не останется около 10 мм иглы для зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При входе иглы в пищевод возникает ощущение пустоты. Длину глазковой иглы, введенной в мышь, следует отмерять до верхней части грудины. Общая длина глазковой иглы составляет 60 мм (Рисунок 3), поэтому около 50 мм глазковой иглы должно быть введено в тело мыши до того, как смесь отвара будет введена в желудок мыши.
7. Введите смесь отвара в желудок мыши. Встреча с сопротивлением или жидкостью, выходящей из угла рта, означает неправильное положение глазковой иглы, чего следует избегать. Кроме того, скорость инъекции необходимо замедлить, если формула отвара густая.
8. Отпустите мышь и наблюдайте за ними в течение 10 минут. Зонд проходит успешно, если не наблюдается нарушений дыхания и возвращает мышь в клетку (рис. 4).

7. Курс лечения

1. Чтобы изучить терапевтическую эффективность отвара Ици Цзеду, создайте контрольную группу и группу отвара Ици Цзеду. Мышам контрольной группы вводят физиологический раствор один раз в сутки в течение 28 дней. Мышам из группы отвара Yiqi Jidue следует вводить отвар Yiqi Jidue один раз в день в течение 28 дней.

8. Побочные реакции

1. Внимательно наблюдайте за состоянием мышей после того, как их поместили обратно в клетку, включая потерю веса и снижение психического статуса из-за неспособности пищи попасть в желудок.
2. Мыши будут испытывать затрудненное дыхание и одышку из-за обструкции трахеи, вызванной пищей, и будут кашлять, пытаясь очистить трахею. Если какой-либо из этих симптомов наблюдается во время зонда, немедленно прекратите зонд и усыпите мышей.

Результаты

Ингибирующее действие отвара Yiqi Jidue на рост остеосаркомы in vivo определяли на модели мыши с интратибиальным ксенотрансплантатом остеосаркомы, которую получали путем введения клеток остеосаркомы 143B в большеберцовую кость мышей-атимов. Отвар Yiqi Jidue вводили мышам группы отвара Yiqi Jiedu ?...

Обсуждение

Клиническая эффективность назначаемых трав в традиционной китайской медицине во многом связана с вводимой дозой и лекарственной формой; Поэтому в клинической практике, а также для повышения надежности результатов экспериментов необходимо разработать стандартизированную стратегию ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells