골육종 모델 마우스에서 중국 전통 의학의 달인 공식에 대한 Gavage 전략

요약

이 프로토콜은 골육종 마우스 모델의 Yiqi Jiedu 달인을 예로 들어 달인 공식 및 gavage 기술의 자세한 표준화 프로세스를 제공합니다. 동물 보호에 대해 설명하고 연구 데이터의 신뢰성을 개선하여 생체 내 달인 공식의 치료 효능 및 분자 메커니즘을 조사하기 위한 효과적인 전략을 제공합니다.

초록

달인 제형은 중국 전통 의학에서 가장 일반적으로 사용되는 제형이며 경구 투여에 의해 수천 년 동안 임상 실습에 적용되어 빠른 효과, 쉬운 흡수 및 환자의 특정 증후군에 따른 개별화된 치료가 특징입니다. 달인 공식의 품질은 중국 전통 의학의 임상 효능에 직접적인 책임이 있습니다. 따라서 달인 공식의 표준화 과정은 주관적인 요인으로 인한 달인 품질의 차이를 피하는 데 중요합니다. 한편, 임상실험의 한계로 인해 생쥐와 같이 인간 질병을 가진 작은 동물은 한의학의 달인 공식을 포함하여 다양한 중재의 치료 효능과 포괄적인 메커니즘을 탐구하기 위해 의학 연구에 자주 사용됩니다. 결과적으로, 중요한 경구 투여 방법으로서, 숙련된 위부 기술은 잠재적인 식도 손상 및 약물 유출을 방지하기 위해 특히 중요하며, 이는 각 모델 동물에 동일한 양의 약물이 투여되도록 보장하여 정확한 실험 결과를 이끌어 낼 것입니다. 또한, 동물 복지를 보호하고 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 표준화된 달인 공식 제조 방법과 숙련된 개비 전략이 필요합니다. 여기에서는 골육종 마우스 모델에서 Yiqi Jiedu 달인을 예로 들어 달인 공식과 gavage 기술의 자세한 표준화 과정을 보고했습니다. 효능은 종양 부피에 의해 평가되었습니다. 이 프로토콜은 동물 보호를 극대화하고 연구 데이터의 신뢰성을 향상시켜 향후 중국 전통 의학에 대한 달인 공식의 치료 효능 및 분자 메커니즘을 조사하기 위한 효과적인 전략을 제공할 것입니다.

서문

달인 공식은 중국 전통 의학과 액체 의약 ^1,2의 가장 일반적으로 사용되는 제형입니다. 중국 전통 의학의 달인 공식은 약초를 물에 담근 후 물에 달인 다음 여과하여 찌꺼기를 버리는 방식으로 가공됩니다.

달인 제형은 특히 한의학의 증거 기반 치료의 특성에 따라 임상적 필요성에 따라 개별화될 수 있기 때문에 경구 투여를 통한 이 제형은 구체적이고 대체할 수 없는 장점으로 수천 년 동안 임상 실습에 적용되어 왔습니다 ^3,4. 달인 공식의 품질은 임상 효능과 직접적인 관련이 있습니다. 따라서 활성 성분이 최대한 추출되고 보호되도록 표준화된 달인 방법의 원칙에 따라 달인 공식을 준비해야 합니다³. 한편, 달인 준비가 된 의약품은 임상 실습에 사용되는 생 한약의 주요 형태입니다. 처방된 달인 준비가 된 의약품의 품질 표준 및 생산 방법은 중국 약전²의 규정을 준수해야 합니다. 또한, 처방된 달인 준비가 된 약은 찬물에 30분 이상 담가야 하며, 그 전에 특수 약제 냄비에 달여⁵. 연구에 따르면 대부분의 유효 성분은 두 번 달여서 추출할 수 있으며, 의료기관에서 한약의 달임실 관리 실무 강령에서도 달인을 두 번 하도록 규정하고 있습니다 ^4,6,7. 딱딱한 식감이나 강장제와 같은 특별한 한약재를 처방하는 경우 달인 시간을 연장하는 것이 좋습니다. 달인 제조법과 직접 접촉하는 달인 기구 및 보관 용기는 처방된 달인 준비가 된 약이 담겨있는 용기에서 시작하여 화학적으로 안정적이어야 하며 캐서롤, 세라믹, 유리 및 스테인리스 스틸과 같은 뚜껑이 있어야 합니다. 그러나 알루미늄 및 일반 플라스틱 제품은 사용해서는 안 되며, 철 및 기타 부식성 기구는 치료 효능을 감소시키고 심지어 해로운 영향을 미칠 수 있는 화학 반응을 피하기 위해 금지되어야 합니다 ^4,6,7.

임상 실험 수행의 한계로 인해 생쥐와 같은 인간 질병을 지닌 작은 동물은 의학 연구에서 종종 중국 전통 의학의 달인 공식을 포함한 다양한 중재의 치료 효능과 포괄적인 메커니즘을 탐구하는 데 사용됩니다 ^8,9; 그러나 인간과 달리 달인 공식은 매일 준비해야 하며, 함께 혼합해야 하며, 임상 실습에서 하루에 2번 신선하게 투여해야 합니다. 동물은 필요한 용량에 맞춰 자발적으로 약을 복용할 수 없으며, 현재 한의학과 관련된 대부분의 동물실험은 달인 공식의 위비지 기반 경구 투여입니다. 생체 내 동물 실험에 사용되는 달인 공식은 미리 준비하고, 분주하고, -20 °C에서 보관하고, 사용 직전에 해동해야합니다 ^3,4,10. 더욱이, 수준 이하의 동물 고정과 주사 바늘 조작은 불필요한 부상과 부정적인 감정의 위험을 증가시킵니다. 그러므로, 경구용 약물 전달의 중요한 방법으로서, 가능한 식도 손상 및 약물 유출을 피하기 위해 숙련된 위부 기술이 특히 중요하며, 따라서 정확한 실험 결과를 얻기 위해 각 모델 동물이 동일한 양의 처방된 생약을 받도록 합니다. 여기에서는 한의학의 달인 공식에 대한 개비지 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Yiqi Jiedu 달인을 샘플로 사용하여 골육종 모델 마우스의 자세한 gavage 기술을 설명합니다. 이 실험에는 생후 4주 된 수컷 무흉선 마우스(BALB/c 누드)를 사용하여 상하이 중국 전통 의학 대학의 실험 동물 센터의 SPF 등급 사육실에서 사육했습니다. 모든 동물실험은 상하이중의과대학 동물관리위원회의 승인을 받았으며 실험동물 윤리강령(동물윤리승인번호: PZSHUTCM2304060007)을 준수하고 실험동물과 관련된 국제 요건에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 재료

1. 한약초(인삼 42g, 헤디오티스 디푸사 52.5g, 가시 두개골 허브 31.5g), 주사기 1mL, 12G/55mm 팔꿈치 개비지 바늘(그림 1)을 구합니다.

2. 복용량 결정

1. 표준 체중 60kg인 성인의 일일 복용량은 인삼 12g, 백삼 15g, 가시 두개골 허브 9g이며, 총 36g, 즉 달인 준비가 된 약/체중 0.6g입니다. 체표면적¹¹에 따라 표준 체중 60kg의 성인과 표준 체중 25g의 마우스 사이의 등가 용량 12 회, 저용량 6 회, 고용량 24 회를 참조하고 예비 데이터뿐만 아니라 현재 연구에서 생쥐에 대해 Yiqi Jiedu 달인 20 배 투여 비율을 사용합니다. 따라서 쥐에 대한 투여량은 체중 kg당 달인 준비 의약품 12g이었습니다.
2. 다음 방정식을 사용하여 각 마우스의 투여량을 계산합니다.
   마우스용 용량(스탠드 체중) = 성인용 용량(스탠드 체중) x 20(지정된 등가 용량비).
   각 마우스의 일일 투여량은 200μL에 0.3g[(달인 준비 의약품 12g/체중 1000g) x 체중 25g]이며 최종 농도는 1.5g/mL입니다.
3. 28일 동안 gavage를 투여한 Yiqi Jiedu 달인 그룹의 쥐(n=7)에 대한 총 달인 준비 약은 58.8g이 됩니다. 이를 39.2mL로 농축하여 최종 농도 1.5g/mL에 도달합니다.
4. 달인 및 개비젼 단계에서 발생할 수 있는 약물 손실을 고려하고 계산의 편의를 위해 총 126g(인삼 42g, 백삼 52.5g, 가시두개골 허브 31.5g)을 달인 약으로 준비하고, 최종 부피 84mL로 농축한다.

3. 세포 공급원 및 배양

1. ATCC 세포 은행에서 인간 유래 143B 골육종 세포를 구입하십시오.
2. 10cm 세포 배양 접시에 10% FBS, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 10mL의 MEM 배지에 1 x 10⁶ 143B 세포를 파종합니다.
3. 세포가 37%-5% 합류할 때까지 2%_CO2 인큐베이터에서 143B 세포를 배양합니다.

4. 모델링 방법

1. 80% confluent 배양된 143B 세포를 수집하고, 6mL의 10% 혈청 함유 MEM 배지에 재현탁하고, 1:1의 부피비로 기저막 매트릭스 겔과 혼합하여 최종 농도가 1 x 10⁷ cells/mL인 세포 현탁액을 만듭니다.
2. 10μL의 세포 현탁액을 각 흉선성 마우스의 좌측 경골에 주입하여 이전 간행물¹²에서 설명한 바와 같이 in situ xenograft osteosarcoma 마우스 모델을 확립합니다. 간단한 단계는 다음과 같습니다.
   1. PBS로 세포를 2번 세척합니다. 0.25% 트립신 1.5mL로 세포를 3분 동안 트립신화합니다. 10% 혈청 함유 MEM 배지 6mL를 추가합니다. 15mL 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다.
   2. 세포 계수 플레이트의 챔버에 20μL의 세포 현탁액을 흡입하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 계산합니다. 실온에서 800 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
   3. 피펫으로 상층액을 버리고 세포 펠릿을 8.5mg/mL 기저막 매트릭스에 재현탁시킨 다음 얼음 위에 놓습니다.
   4. 마우스를 2% 이소플루란과 98% 산소(산소 유량, 2L/min)에 노출시켜 마취합니다. 마취 중 건조함을 방지하기 위해 눈에 소량의 수의사 연고를 바르십시오.
   5. 환기가 잘 되는 곳에서 전체 절차를 수행하십시오. 골육종 세포 주사 전에 발을 부드럽게 만져 각 쥐가 깊은 마취 상태에 있는지 확인하십시오. 마우스에 여전히 Twitch 또는 Jerk와 같은 응답이 있는 경우. 마우스에 여전히 트위치 또는 저크와 같은 응답이 있는 경우 이러한 응답이 사라질 때까지 더 오래 기다립니다.
   6. 마우스를 누운 자세로 놓습니다. 엄지와 검지를 사용하여 쥐의 발목을 잡고 베타딘과 70% 에탄올 면봉을 번갈아 3회 번갈아 가며 경골 주사 부위를 소독합니다.
   7. 바늘을 1mL 주사기에 부착하고 바늘 끝이 경골 축과 평행한 주사 부위를 향하도록 합니다. 바늘을 경피적으로 삽입하여 경골 플랫폼을 통해 경골의 말단 끝을 향해 구멍을 뚫습니다.
   8. 이전에 얼음 위에 놓인 골육종 세포 현탁액을 마이크로 볼륨 주사기에 넣고 경골의 1mL 주사기를 골육종 세포 로딩 마이크로 볼륨 주사기로 교체합니다. 약 10μL(1 x 10⁷ cells/mL)의 골육종 세포 현탁액을 각 흉선증 마우스의 경골에 천천히 주입합니다.
   9. 주입 부위에서 마이크로 볼륨 주사기를 제거하고 면봉으로 주사 부위를 30 초 정도 누릅니다. 마우스를 깨끗한 케이지에 다시 넣고 10분 동안 회복을 관찰합니다.

5. 한의학 달인 공식의 준비 (그림 2)

1. 2단계에 따라 복용량을 계산합니다.
2. 고가의 약초인 인삼을 제외한 모든 약초를 약재 표면보다 3cm 높은 식수에 30분간 담근 후 아래 설명과 같이 달여주기를 2회 실시한다.
3. 강한 불에서 끓을 때까지 가열한 다음 약한 불에서 15-25분 동안 가열하여 첫 번째 달인을 수행합니다. 약한 화재는 일반적으로 80 °C에서 100 °C 범위의 온도를 가진 저전력 열을 말하며, 강한 화재는 일반적으로 200 °C에서 300 °C 범위의 고출력 열을 말합니다.
4. 달인 액체를 하나의 용기에 붓습니다.
5. 약초를 식수에 넣고 약 표면이 잠길 정도의 양으로 가열하여 강한 불로 끓인 다음 약한 불에서 15-25분 동안 가열하여 두 번째 달인을 수행합니다.
6. 5.4단계와 동일한 용기에 달인 액체를 붓습니다.
7. 인삼 42g을 약수보다 3cm 높은 식수로 따로 담가 달인다.
8. 불린 인삼을 강한 불로 60분 동안 가열하여 첫 번째 달인을 수행합니다.
   5.4단계와 동일한 용기에 달인 액체를 붓습니다.
9. 약불로 40분 동안 가열하여 약 표면이 잠길 정도의 양으로 식수에 인삼을 두 번째로 달입니다. 5.4단계와 동일한 용기에 달인 액체를 붓습니다.
   알림: 달인에 사용되는 용기는 캐서롤(임상 실습에서 가장 일반적으로 사용됨), 세라믹, 유리 및 스테인리스 스틸과 같이 약용 물질과의 화학 반응을 피하기 위해 화학적으로 안정적이어야 합니다. 다른 단계에서 얻은 모든 달인 액체는 동일한 용기에 넣어야 합니다.
10. 고무 밴드로 계량컵 입구에 고정된 3겹의 거즈를 사용하여 달인 액체를 혼합하고 여과합니다.
11. 냄비에 있는 강한 불에서 여과된 달인을 끓인 다음 약한 불로 바꾸고 목표 농도(최종 농도 84g/mL, 최종 농도 1.5g/mL)에 도달할 때까지 약한 불을 유지합니다.
12. 1주일 동안 위내 투여에 필요한 용량에 따라 농축 달인 21mL 분취액을 준비하고, 분취액을 -20°C의 냉장고에 보관한다.

6. Gavage 장치를 이용한 마우스의 Gavage 투여

1. 마우스 케이지의 표면이나 다른 거친 표면에 마우스를 놓습니다.
2. 오른손의 엄지와 검지로 쥐의 꼬리를 잡습니다. 그런 다음 왼손의 엄지, 검지, 중지로 마우스의 목을 잡습니다.
3. 왼손의 다른 두 손가락으로 마우스 꼬리를 잡고 마우스의 머리, 목, 몸통을 일직선으로 만듭니다.
   알림: 잡는 전체 과정에서 마우스를 편안하게 유지하십시오. 마우스가 계속 움직이기 위해 고군분투하면 마우스가 이완될 때까지 잡는 과정을 수행해야 합니다.
4. 오른손에 gavage 장치를 잡고 체중 20g(달인 공식 100μL/마우스 체중 10g)의 마우스용 달인 공식 200μL를 로드합니다.
5. 모서리에서 입에 가비지 바늘을 삽입하고 혀를 쥐의 위턱에 대고 밉니다.
6. 마우스 몸체를 같은 방향으로 유지하고 약 10mm의 망막 바늘이 바깥쪽에 남을 때까지 식도를 따라 위 쪽으로 갑을 부드럽게 밉니다.
   알림: 개비지 바늘이 식도에 들어갈 때 속이 빈 느낌이 있습니다. 마우스에 삽입된 개비지 바늘의 길이는 흉골 상단까지 측정해야 합니다. 개비지 바늘의 총 길이는 60mm(그림 3)이므로 달인 공식을 쥐의 위장에 주입하기 전에 약 50mm의 개비지 바늘을 쥐의 몸에 삽입해야 합니다.
7. 쥐의 위장으로 달인 공식을 주사하십시오. 입 모서리에서 저항이나 액체가 나오면 개비지 바늘이 잘못 배치되므로 피해야 합니다. 또한 달인 공식이 두꺼우면 사출 속도를 늦춰야 합니다.
8. 마우스를 놓고 10분 동안 관찰합니다. 호흡 이상이 관찰되지 않고 마우스를 케이지로 되돌리면 gavage가 성공한 것입니다(그림 4).

7. 치료 과정

1. Yiqi Jiedu 달인의 치료 효능을 탐구하기 위해 대조군과 Yiqi Jiedu 달인 그룹을 설정하십시오. 대조군의 마우스의 경우 28일 동안 하루에 한 번 생리식염수를 투여합니다. Yiqi Jiedu 달인 그룹의 쥐의 경우 Yiqi Jiedu 달인 물을 28 일 동안 하루에 한 번 투여하십시오.

8. 부작용

1. 케이지에 다시 넣은 후 먹이가 위장으로 들어갈 수 없어 체중 감소 및 정신 상태 저하를 포함하여 쥐의 상태를 면밀히 관찰하십시오.
2. 생쥐는 음식으로 인한 기관 폐쇄로 인해 호흡 곤란과 숨가쁨을 경험하고 기관을 청소하기 위해 기침을 합니다. 이러한 증상 중 하나라도 관찰되면 즉시 개구를 멈추고 쥐를 안락사시키십시오.

결과

생체 내 골육종의 성장에 대한 Yiqi Jiedu 달인의 억제 효과는 143B 골육종 세포를 흉선성 마우스의 경골에 주입하여 제조한 경골 내 이종이식 골육종 마우스 모델에서 결정되었습니다. Yiqi Jiedu 달인은 143B 주입의 둘째 날부터 28 일 동안 Gavage에 의해 Yiqi Jiedu 달인 그룹의 마우스에 투여되었습니다. 생리식염수를 대조군의 마우스에 투여하였다. 모든 쥐는 28일 후에 안락사되었다. 그 결과 Yiqi Jied...

토론

중국 전통 의학에서 처방된 약초의 임상적 효능은 주로 투여된 용량 및 제형과 관련이 있습니다. 따라서 표준화된 달임 전략의 수립과 숙련된 관리 프로세스는 임상 실습뿐만 아니라 실험 결과의 신뢰성을 향상시키는 데 필요합니다.

이 연구에서 우리는 먼저 한약의 임상 실습에 사용되는 한약재의 표준화된 달임에 대한 자세한 전략을 제공하여 사람들이 과학적으로 달인 약...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells