אסטרטגיית Gavage לנוסחת מרתח של הרפואה הסינית המסורתית בעכברי מודל אוסטאוסרקומה

Summary

הפרוטוקול מספק תהליך סטנדרטיזציה מפורט של נוסחת מרתח וטכניקת gavage עם מרתח Yiqi Jiedu במודל העכבר אוסטאוסרקומה כדוגמה. הוא מתאר הגנה על בעלי חיים ומשפר את אמינות נתוני המחקר, ומספק אסטרטגיות יעילות לחקר יעילות טיפולית ומנגנונים מולקולריים של נוסחאות מרתח in vivo.

Abstract

נוסחת מרתח היא צורת המינון הנפוצה ביותר ברפואה הסינית המסורתית ומיושמת בפרקטיקה הקלינית במשך אלפי שנים על ידי מתן דרך הפה, המאופיינת בהשפעה מהירה, ספיגה קלה וטיפול אישי המבוסס על תסמונות ספציפיות של חולים. איכות נוסחת המרתח אחראית ישירות ליעילות הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית; לכן, תהליך הסטנדרטיזציה של נוסחת מרתח חשוב כדי למנוע הבדלים באיכות מרתח הנגרמת על ידי גורמים סובייקטיביים. בינתיים, בשל המגבלות של ביצוע ניסויים קליניים, בעלי חיים קטנים הנושאים מחלות אנושיות, כגון עכברים, משמשים לעתים קרובות במחקר רפואי כדי לחקור את היעילות הטיפולית ואת המנגנונים המקיפים של התערבויות שונות, כולל נוסחת מרתח עבור הרפואה הסינית המסורתית. כתוצאה מכך, כשיטת מתן טרנס-אוראלית חשובה, טכניקת ה-gavage המיומנת חשובה במיוחד כדי למנוע נזק פוטנציאלי לוושט ודליפת תרופות, אשר יבטיחו מתן כמות שווה של תרופות לכל חיית מודל, מה שיוביל לתוצאות ניסוי מדויקות. יתר על כן, השיטה הסטנדרטית של הכנת נוסחת מרתח ואסטרטגיית gavage מיומנת נחוצים כדי להגן על רווחת בעלי החיים ולמזער את מספר בעלי החיים בשימוש. כאן, דיווחנו על תהליך סטנדרטיזציה מפורט של נוסחת מרתח וטכניקת gavage עם מרתח Yiqi Jiedu במודל עכבר אוסטאוסרקומה כדוגמה. היעילות הוערכה על ידי נפח הגידול. פרוטוקול זה ימקסם את ההגנה על בעלי חיים וישפר את אמינות נתוני המחקר, ובכך יספק אסטרטגיות יעילות לחקירה עתידית של יעילות טיפולית ומנגנונים מולקולריים של פורמולת מרתח עבור הרפואה הסינית המסורתית in vivo.

Introduction

נוסחת מרתח היא צורת המינון הנפוצה ביותר של הרפואה הסינית המסורתית ותרופות המרפא הנוזליות ^1,2. נוסחת המרתח של הרפואה הסינית המסורתית מעובדת על ידי מרתח עשבי תיבול במים לאחר שהושרו, ואחריו סינון כדי להשליך את השאריות.

מכיוון שניתן להתאים אישית את נוסחת מרתח בהתבסס על צרכים קליניים, במיוחד בהתאם למאפיינים של טיפול מבוסס ראיות ברפואה הסינית המסורתית, צורת מינון זו באמצעות מתן דרך הפה מיושמת בפרקטיקה הקלינית במשך אלפי שנים עם יתרונות ספציפיים וחסרי תחליף ^3,4. איכות נוסחת מרתח קשורה ישירות ליעילות הקלינית. לכן, נוסחת מרתח חייב להיות מוכן על בסיס העקרונות עבור שיטות מרתח סטנדרטי כדי להבטיח את החומרים הפעילים מופקים באופן מקסימלי מוגן³. בינתיים, תרופות מוכנות מרתח הן הצורה העיקרית של עשבי תיבול סיניים גולמיים המשמשים בפועל קליני; תקני האיכות ושיטות הייצור של תרופות מוכנות מרתח שנקבעו חייבים לעמוד בהוראות הפרמקופיאה הסינית². יתר על כן, תרופות מרתח מוכן חייב להיות ספוג במי שתייה קרים לפחות 30 דקות לפני להיות decocted בסיר תרופות מיוחד על ידי חימום⁵. מחקרים הראו כי רוב החומרים הפעילים ניתן לחלץ על ידי decocting במשך פעמיים, ואת הקוד בפועל לניהול חדרי מרתח של תרופות סיניות מסורתיות במוסדות רפואיים גם קובע מרתח להיעשות פעמיים ^4,6,7. אם עשבי תיבול סיניים מיוחדים, כגון אחד עם מרקם קשה או טוניקות, נקבעו, זמן מרתח מומלץ להאריך. כלי מרתח ומיכלי אחסון הבאים במגע ישיר עם נוסחת מרתח, החל מן המיכל שבו תרופות מרתח מוכן ספוגים, צריך להיות יציב מבחינה כימית יש מכסים, כגון תבשילי קדרה, קרמיקה, זכוכית נירוסטה. עם זאת, אלומיניום ומוצרי פלסטיק רגילים אין להשתמש, בעוד ברזל וכלים קורוזיביים אחרים יש לאסור כדי למנוע תגובות כימיות אפשריות, אשר יפחיתו את היעילות הטיפולית ואף לייצר השפעות מזיקות ^4,6,7.

בשל המגבלות של ביצוע ניסויים קליניים, בעלי חיים קטנים הנושאים את מחלות האדם, כגון עכברים, משמשים לעתים קרובות במחקר רפואי כדי לחקור את היעילות הטיפולית ואת המנגנונים המקיפים של התערבויות שונות, כולל נוסחת מרתח של הרפואה הסינית המסורתית ^8,9; עם זאת, בניגוד לבני אדם, נוסחאות מרתח צריך להיות מוכן כל יום, מעורבב יחד, טרי מנוהל 2x ביום בפועל קליני. בעלי חיים אינם מסוגלים לקחת מרצונם את התרופות שלהם בזמן עם המינון הנדרש, ורוב הניסויים בבעלי חיים הקשורים לרפואה הסינית המסורתית הם מתן אוראלי מבוסס gavage של נוסחאות מרתח כיום. נוסחאות המרתח המשמשות לניסויים בבעלי חיים in vivo יש להכין מראש, aliquoted, מאוחסן ב -20 ° C והפשיר ממש לפני השימוש ^3,4,10. יתר על כן, אימוביליזציה תת-תקנית של בעלי חיים ומניפולציה של מחטי gavage מגבירים את הסיכון לפציעות מיותרות ולרגשות שליליים. לכן, כשיטה חשובה למתן תרופות דרך הפה, טכניקת ה-gavage המיומנת חשובה במיוחד כדי למנוע פגיעה אפשרית בוושט ושפיכת סמים, ובכך להבטיח שכל חיית מודל תקבל כמות שווה של צמחי מרפא במרשם כדי להשיג תוצאות ניסוי מדויקות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול gavage עבור נוסחת מרתח של הרפואה הסינית המסורתית.

Protocol

פרוטוקול זה מתאר את טכניקת הגבאג' המפורטת בעכברי מודל אוסטאוסרקומה באמצעות מרתח Yiqi Jiedu כדוגמה. עכברים אתימיים זכרים בני ארבעה שבועות (BALB/c nude) שימשו בניסוי זה והוחזקו בחדר הרבייה ברמת SPF של מרכז חיות מעבדה באוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניהול בעלי חיים והוועדה של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית, עמדו בקוד האתי לחיות מעבדה (מספר אישור אתיקה לבעלי חיים: PZSHUTCM2304060007), ונערכו בהתאמה קפדנית לדרישות הבינלאומיות הקשורות לחיות מעבדה.

1. חומרים

1. השיגו את החומרים הבאים: צמחי מרפא סיניים (ג'ינסנג 42 גרם, Hedyotis diffusa 52.5 גרם, עשב כיפה 31.5 גרם), מזרק 1 מ"ל ומחט מרפק 12G/55 מ"מ (איור 1).

2. קביעת מינון

1. חשב את המינון היומי כדלקמן: המינון היומי למבוגרים עם משקל גוף סטנדרטי של 60 ק"ג הוא ג'ינסנג 12 גרם, Hedyotis diffusa 15 גרם, ועשב כיפה דוקרנית 9 גרם, עם סך של 36 גרם תרופה מוכנה מרתח, כלומר, 0.6 גרם תרופות מוכנות מרתח / ק"ג משקל גוף. בהתייחס 12 פעמים עבור מינון שווה ערך, 6 פעמים עבור מינון נמוך, ו 24 פעמים עבור מינון גבוה בין מבוגרים עם משקל גוף סטנדרטי של 60 ק"ג לבין עכברים עם משקל גוף סטנדרטי של 25 גרם על פי שטח הפנים של הגוף¹¹, כמו גם הנתונים הראשוניים שלנו, להשתמש ביחס מינון 20 פעמים של מרתח Yiqi Jiedu עבור העכברים במחקר הנוכחי, לכן, המינון לעכברים היה 12 גרם תרופות מוכנות למרתח / ק"ג משקל גוף.
2. חשב את המינון עבור כל עכבר באמצעות המשוואה:
   מינון לעכבר (משקל גוף עמידה) = מינון למבוגר (משקל גוף עמידה) x 20 (יחס מינון שווה ערך ייעודי).
   המינון היומי של כל עכבר הוא 0.3 גרם [(12 גרם תרופות מוכנות למרתח / 1000 גרם משקל גוף) x 25 גרם משקל גוף] ב 200 μL עם ריכוז סופי של 1.5 גרם / מ"ל.
3. חשב את סך התרופות המוכנות למרתח עבור עכברים (n = 7) בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu עם ניהול gavage במשך 28 ימים להיות 58.8 גרם. רכז את זה ל 39.2 מ"ל כדי להגיע לריכוז סופי של 1.5 גרם / מ"ל.
4. בהתחשב באובדן סמים אפשרי במהלך מרתח ואת שלבי gavage, ולנוחות החישוב, להכין סך של 126 גרם (ג'ינסנג 42 גרם, Hedyotis diffusa 52.5 גרם, עשב כיפה דוקרנית 31.5 גרם) מרתח מוכן תרופה, להתרכז לתוך נפח סופי של 84 מ"ל.

3. מקור התא ותרבית

1. רכשו תאי אוסטאוסרקומה 143B שמקורם בבני אדם מבנק תאי ATCC.
2. זרע 1 x 10⁶ 143B תאים ב 10 מ"ל של מדיום MEM המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין בצלחת תרבית תאים 10 ס"מ.
3. תרבית תאים 143B ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ עד התאים הם 80%-90% נפגשים.

4. שיטות דוגמנות

1. אספו את 80% תאי התרבית 143B בתרבית, הרחיקו מחדש ל-6 מ"ל של 10% מדיום MEM המכיל בסרום וערבבו עם ג'ל מטריצת קרום מרתף ביחס נפח של 1:1 ליצירת תרחיף תאים עם ריכוז סופי של 1 x 10⁷ תאים/מ"ל.
2. הזריקו 10 μL של תרחיף התא לתוך השוקה השמאלית של כל עכבר אתימי כדי ליצור מודל עכבר אוסטאוסרקומה באתרו xenograft, כפי שתואר בפרסום הקודם שלנו¹². השלבים בקצרה הם כדלקמן.
   1. שטפו את התאים 2x עם PBS. טריפסיניזציה של התאים עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 3 דקות. יש להוסיף 6 מ"ל של מדיית MEM המכילה 10% בסרום. לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   2. יש לשאוף 20 μL של תרחיף תאים לתוך התא של צלחת ספירת התאים ולחשב את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא במטריצת קרום מרתף של 8.5 מ"ג/מ"ל והניחו אותם על קרח.
   4. מרדימים את העכברים על ידי חשיפתם ל-2% איזופלורן ו-98% חמצן (קצב זרימת חמצן, 2 ליטר/דקה). יש למרוח כמות קטנה של משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   5. בצע את כל ההליך באזור מאוורר היטב. לפני הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, ודא שכל עכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי נגיעה עדינה ברגל; אם העכבר עדיין כולל תגובות, כגון Twitch או jerk. המתן זמן רב יותר אם העכבר עדיין כולל תגובות, כגון עווית או אידיוט, עד שתגובות אלה ייעלמו.
   6. הנח את העכבר במצב שכיבה. החזק את קרסול העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה וחטא את אתר ההזרקה של השוקה עם שלושה סיבובים לסירוגין של בטדין ו 70% אתנול ספוגית.
   7. חברו את המחט למזרק בנפח 1 מ"ל וכוונו את קצה המחט לכיוון מקום ההזרקה המקביל לציר השוקה. החדרה מלעורית של המחט כדי לקדוח חור דרך פלטפורמת השוקה לכיוון הקצה הדיסטלי של השוקה.
   8. טען את תרחיף תאי האוסטאוסרקומה שהונח בעבר על קרח לתוך מזרק מיקרו-נפח והחלף את מזרק 1 מ"ל בשוקה במזרק מיקרו-נפח טעון תאי אוסטאוסרקומה. הזריקו באיטיות כ-10 מיקרוליטר של (1 x 10⁷ תאים/מ"ל) תרחיף תאי אוסטאוסרקומה לתוך עצם השוקה של כל עכבר אתימי.
   9. הסר את מזרק microvolume מאתר ההזרקה, ולחץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן במשך כ 30 שניות. החזירו את העכבר לכלוב נקי והתבוננו בהחלמתו במשך 10 דקות.

5. הכנת נוסחת מרתח ברפואה סינית מסורתית עבור gavage (איור 2)

1. חשב את המינון לפי שלב 2.
2. השרו את כל צמחי המרפא למרתח, למעט ג'ינסנג העשב היקר, במי שתייה עם רמה גבוהה ב -3 ס"מ משטח התרופה, למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצעו את מרתח 2x כמתואר להלן.
3. בצע את מרתח הראשון על ידי חימום רותחים על אש חזקה, ולאחר מכן חימום במשך 15-25 דקות על אש קלה. אש קלה מתייחסת לחום בעוצמה נמוכה עם טמפרטורות הנעות בדרך כלל בין 80 °C (75 °F) ל -100 °C (75 °F), בעוד אש חזקה מתייחסת לחום בעוצמה גבוהה הנע בדרך כלל בין 200 °C (70 °F) ל -300 °C (75 °F).
4. יוצקים את נוזל מרתח לתוך מיכל אחד.
5. בצע את מרתח השני על ידי חימום צמחי מרפא במי שתייה, עם נפח בדיוק מספיק כדי לטבול את פני התרופה, כדי רותחים על אש חזקה, ולאחר מכן חימום במשך 15-25 דקות על אש קלה.
6. יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4.
7. להשרות decoct 42 גרם של ג'ינסנג בנפרד, עם מי שתייה 3 ס"מ גבוה יותר משטח התרופה, שכן הוא יקר.
8. בצע את מרתח הראשון של ג'ינסנג ספוג על ידי חימום אותו על אש חזקה במשך 60 דקות.
   יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4.
9. בצע את מרתח השני של ג'ינסנג במי שתייה עם נפח בדיוק מספיק כדי לטבול את משטח התרופה, על ידי חימום על אש קלה במשך 40 דקות. יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4.
   הערה: המיכלים המשמשים למרתח צריכים להיות יציבים מבחינה כימית, כגון תבשילי קדירה (הנפוצים ביותר בפרקטיקה הקלינית), קרמיקה, זכוכית ונירוסטה כדי למנוע תגובות כימיות אפשריות עם החומרים הרפואיים. כל נוזל מרתח המתקבל משלבים שונים חייב להיות לשים באותו מיכל.
10. מערבבים ומסננים את נוזל המרתח באמצעות שלוש שכבות של גזה קבועה בפתח מדידה עם גומיות.
11. מרתיחים את המרתח המסונן על אש חזקה בסיר, ואז מחליפים לאש קלה ושומרים את האש הקלה עד שמגיעים לריכוז היעד (נפח סופי של 84 מ"ל עם ריכוז סופי של 1.5 גרם/מ"ל).
12. הכן 21 מ"ל aliquots של מרתח מרוכז על פי המינון הנדרש לניהול intragastric במשך שבוע אחד, ולאחסן את aliquots במקרר ב -20 מעלות צלזיוס.

6. מתן גאבאג' בעכברים באמצעות מכשיר gavage

1. הנח את העכבר על פני כלוב העכבר או משטח מחוספס אחר.
2. אחוז בזנב העכבר עם האגודל והאצבע המורה של יד ימין. לאחר מכן, אחוז בצוואר העכבר עם האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית של יד שמאל.
3. החזק את זנב העכבר עם שתי האצבעות האחרות של יד שמאל כדי להפוך את הראש, הצוואר והגוף של העכבר בקו ישר.
   הערה: הקפד לשמור על העכבר רגוע במהלך כל תהליך האחיזה. אם העכבר ממשיך להתקשות לנוע, יש לבצע את תהליך האחיזה עד להרפיית העכבר.
4. החזק את התקן gavage ביד ימין וטען 200 μL של נוסחת מרתח עבור עכבר עם משקל גוף של 20 גרם (נוסחת מרתח 100 μL / 10 גרם משקל גוף של עכבר).
5. הכנס את מחט gavage לתוך הפה מהפינה ולדחוף את הלשון כנגד הלסת העליונה של העכבר.
6. שמור על גוף העכבר באותו כיוון ודחף בעדינות את מחט gavage לכיוון הבטן לאורך הוושט עד כ 10 מ"מ של מחט gavage נשאר בחוץ.
   הערה: יש תחושה חלולה כאשר מחט gavage נכנס לתוך הוושט. יש למדוד את אורך מחט ה-gavage המוחדרת לעכבר עד לחלק העליון של עצם החזה. האורך הכולל של מחט ה-gavage הוא 60 מ"מ (איור 3), ולכן יש להחדיר כ-50 מ"מ של מחט ה-gavage לגוף העכבר לפני הזרקת נוסחת המרתח לקיבתו של עכבר.
7. להזריק את נוסחת מרתח לתוך הבטן של העכבר. עמידה בהתנגדות או נוזל היוצא מפינת הפה פירושה מיקום שגוי של מחט הגבאג', שיש להימנע ממנה. בנוסף, יש להאט את מהירות ההזרקה אם נוסחת המרתח עבה.
8. שחררו את העכבר והתבוננו בהם במשך 10 דקות. הפער מצליח אם לא נצפתה חריגת נשימה ומחזירים את העכבר לכלוב (איור 4).

7. מהלך הטיפול

1. כדי לחקור את היעילות הטיפולית של מרתח Yiqi Jiedu, הקימו קבוצת ביקורת וקבוצת מרתח Yiqi Jiedu. עבור עכברים בקבוצת הביקורת, לתת מלוחים פיזיולוגיים, פעם ביום במשך 28 ימים. עבור עכברים בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu, לנהל את מרתח Yiqi Jiedu פעם ביום במשך 28 ימים.

8. תגובות שליליות

1. שימו לב מקרוב למצב העכברים לאחר שהוחזרו לכלוב, כולל ירידה במשקל וירידה במצב הנפשי עקב חוסר היכולת של מזון להיכנס לקיבה.
2. עכברים יחוו קשיי נשימה וקוצר נשימה עקב חסימת קנה הנשימה הנגרמת על ידי מזון וישתעלו בניסיון לנקות את קנה הנשימה. אם אחד מהתסמינים הללו נצפה במהלך gavage, מיד להפסיק את gavage ולהרדים את העכברים.

תוצאות

ההשפעה המעכבת של מרתח Yiqi Jiedu על גדילת אוסטאוסרקומה in vivo נקבעה במודל עכבר תוך טיביאלי xenograft osteosarcoma, שהוכן על ידי הזרקת תאי אוסטאוסרקומה 143B לתוך השוקה של עכברים אתימיים. מרתח Yiqi Jiedu ניתן לעכברים של קבוצת מרתח Yiqi Jiedu על ידי gavage במשך 28 ימים החל מהיום השני של זריקת 143B. מלח פיזיולוגי ניתן לעכבר?...

Discussion

היעילות הקלינית של צמחי המרפא שנקבעו ברפואה הסינית המסורתית קשורה במידה רבה למינון ולצורת המינון המנוהלים; לכן, הקמת אסטרטגיית מרתח סטנדרטית ותהליך ניהול מיומן נחוצים בפועל הקליני, כמו גם בשיפור האמינות של תוצאות הניסוי.

במחקר זה, סיפקנו לראשונה אסטרטגיה מפורטת עבור מרתח ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells