Estratégia de Gavagem para Fórmula de Decocção da Medicina Tradicional Chinesa em Camundongos Modelo de Osteossarcoma

Resumo

O protocolo fornece um processo detalhado de padronização da fórmula de decocção e técnica de gavagem com decocção Yiqi Jiedu no modelo de osteossarcoma de camundongos como exemplo. Descreve a proteção animal e melhora a confiabilidade dos dados de pesquisa, fornecendo estratégias eficazes para investigar a eficácia terapêutica e os mecanismos moleculares das fórmulas de decocção in vivo.

Resumo

A fórmula de decocção é a forma farmacêutica mais utilizada na medicina tradicional chinesa e aplicada na prática clínica há milhares de anos por administração transoral, que se caracteriza por efeito rápido, fácil absorção e tratamento individualizado baseado nas síndromes específicas dos pacientes. A qualidade da fórmula de decocção é diretamente responsável pela eficácia clínica da medicina tradicional chinesa; Portanto, o processo de padronização da fórmula de decocção é importante para evitar diferenças na qualidade da decocção causadas por fatores subjetivos. Enquanto isso, devido às limitações da realização de experimentos clínicos, pequenos animais portadores de doenças humanas, como camundongos, são frequentemente usados em pesquisas médicas para explorar a eficácia terapêutica e mecanismos abrangentes de diferentes intervenções, incluindo a fórmula de decocção para a medicina tradicional chinesa. Consequentemente, como um importante método de administração transoral, a técnica de gavagem habilidosa é particularmente importante para evitar possíveis danos ao esôfago e derramamento de drogas, o que garantirá uma quantidade igual de medicamento sendo administrada a cada animal modelo, levando a resultados experimentais precisos. Além disso, o método padronizado de preparação da fórmula de decocção e a estratégia de gavagem habilidosa são necessários para proteger o bem-estar animal e minimizar o número de animais utilizados. Aqui, relatamos um processo detalhado de padronização da fórmula de decocção e técnica de gavagem com decocção Yiqi Jiedu em modelo de osteossarcoma em camundongos como exemplo. A eficácia foi avaliada pelo volume tumoral. Este protocolo maximizará a proteção animal e melhorará a confiabilidade dos dados de pesquisa, fornecendo estratégias eficazes para futuras investigações da eficácia terapêutica e dos mecanismos moleculares da fórmula de decocção para a medicina tradicional chinesa in vivo.

Introdução

A fórmula de decocção é a forma farmacêutica mais utilizada da medicina tradicional chinesa e dos medicamentos líquidos ^1,2. A fórmula de decocção da medicina tradicional chinesa é processada pela decodificação das ervas em água após serem embebidas e, seguidas de filtragem para descartar as borras.

Como a fórmula de decocção pode ser individualizada com base nas necessidades clínicas, especialmente de acordo com as características do tratamento baseado em evidências na medicina tradicional chinesa, essa forma farmacêutica via administração transoral tem sido aplicada na prática clínica há milhares de anos com vantagens específicas e insubstituíveis ^3,4. A qualidade da fórmula de decocção está diretamente relacionada à eficácia clínica. Portanto, a fórmula de decocção deve ser preparada com base nos princípios dos métodos de decocção padronizados para garantir que os ingredientes ativos sejam maximamente extraídos e protegidos³. Enquanto isso, os medicamentos prontos para decocção são a principal forma de ervas chinesas cruas usadas na prática clínica; as normas de qualidade e os métodos de produção dos medicamentos prontos para decocção prescritos devem respeitar as disposições da Farmacopeia Chinesa². Além disso, os medicamentos prontos para decocção prescritos devem ser embebidos em água fria por pelo menos 30 minutos antes de serem decocados em uma panela farmacêutica especial por aquecimento⁵. Estudos têm mostrado que a maioria dos princípios ativos pode ser extraída por decocção por duas vezes, e o Código de Prática para a Administração de Salas de Decocção de Medicamentos Tradicionais Chineses em Instituições Médicas também prescreve decocção para ser feita duas vezes ^4,6,7. Se ervas chinesas especiais, como uma com textura dura ou tônicos, são prescritas, o tempo de decocção é recomendado para ser prolongado. Os utensílios de decocção e recipientes de armazenamento que entram diretamente em contato com a fórmula de decocção, a partir do recipiente em que os medicamentos prontos para decocção prescritos estão embebidos, devem ser quimicamente estáveis e ter tampas, como caçarolas, cerâmicas, vidro e aço inoxidável. No entanto, o alumínio e os produtos plásticos comuns não devem ser utilizados, enquanto o ferro e outros utensílios corrosivos devem ser proibidos para evitar possíveis reações químicas, que reduzirão a eficácia terapêutica e até produzirão efeitos nocivos ^4,6,7.

Devido às limitações da realização de experimentos clínicos, pequenos animais portadores de doenças humanas, como camundongos, são frequentemente utilizados em pesquisas médicas para explorar a eficácia terapêutica e mecanismos abrangentes de diferentes intervenções, incluindo a fórmula de decocção da medicina tradicional chinesa ^8,9; No entanto, ao contrário dos seres humanos, as fórmulas de decocção devem ser preparadas todos os dias, misturadas e administradas na hora 2x ao dia na prática clínica. Os animais são incapazes de tomar voluntariamente seus medicamentos a tempo com a dosagem necessária, e a maioria dos experimentos animais relacionados à medicina tradicional chinesa são administração oral baseada em gavagem das fórmulas de decocção no momento. As fórmulas de decocção utilizadas para experimentos in vivo com animais devem ser preparadas previamente, alíquotas, armazenadas a -20 °C e descongeladas imediatamente antes do uso ^3,4,10. Além disso, a imobilização de animais abaixo do padrão e a manipulação com agulhas de gavagem aumentam o risco de lesões desnecessárias e emoções negativas. Portanto, como um importante método de liberação transoral de fármacos, a técnica de gavagem habilidosa é particularmente importante para evitar possíveis lesões esofágicas e derramamento de drogas, garantindo assim que cada animal modelo receba uma quantidade igual de fitoterápicos prescritos para alcançar resultados experimentais precisos. Aqui, fornecemos um protocolo de gavagem para a fórmula de decocção da medicina tradicional chinesa.

Protocolo

Este protocolo descreve a técnica detalhada de gavagem em camundongos modelo de osteossarcoma usando a decocção Yiqi Jiedu como amostra. Camundongos atímicos machos com quatro semanas de idade (BALB/c nude) foram usados neste experimento e mantidos na sala de reprodução grau SPF do Laboratory Animal Center da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê e Gestão Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai, cumpriram o Código de Ética para Animais de Laboratório (Animal Ethics Approval Number: PZSHUTCM2304060007) e conduzidos em estrita conformidade com os requisitos internacionais relacionados a animais de laboratório.

1. Materiais

1. Obter os seguintes materiais: ervas chinesas (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, erva farpada 31,5 g), seringa de 1 mL e agulha de gavagem de cotovelo de 12 G/55 mm (Figura 1).

2. Determinação da dosagem

1. Calcule a dose diária da seguinte forma: a dose diária para adultos com um peso corporal padrão de 60 kg é Ginseng 12 g, Hedyotis diffusa 15 g, e erva caveira farpada 9 g, com um total de 36 g de medicamento pronto para decocção, ou seja, 0,6 g de medicamentos prontos para decocção/kg de peso corporal. Referindo-se às 12 vezes para dose equivalente, 6 vezes para dose baixa e 24 vezes para dose alta entre os adultos com peso corporal padrão de 60 kg e os camundongos com peso corporal padrão de 25 g de acordo com a área de superfície corporal¹¹, bem como nossos dados preliminares, use uma razão de dose de 20 vezes de decocção Yiqi Jiedu para os camundongos no estudo atual, portanto, a dosagem para camundongos foi de 12 g de medicamentos prontos para decocção/kg de peso corporal.
2. Calcule a dosagem para cada rato utilizando a equação:
   Dosagem para camundongo (peso corporal em pé) = dosagem para adulto (peso corporal em pé) x 20 (relação de dose equivalente designada).
   A dose diária de cada rato é de 0,3 g [(12 g de medicamentos prontos para decocção/1000 g de peso corporal) x 25 g de peso corporal] em 200 μL com uma concentração final de 1,5 g/ml.
3. Calcular o total de medicamentos prontos para decocção para camundongos (n=7) no grupo de decocção Yiqi Jiedu com administração de gavagem por 28 dias para ser 58,8 g. Concentrar em 39,2 mL para atingir uma concentração final de 1,5 g/mL.
4. Considerando a possível perda de drogas durante as fases de decocção e gavagem, e para a conveniência do cálculo, prepare um total de 126 g (Ginseng 42 g, Hedyotis diffusa 52,5 g, erva caveira farpada 31,5 g) de medicamento pronto para decocção, concentrado em um volume final de 84 mL.

3. Fonte e cultura celular

1. Compre células de osteossarcoma 143B derivadas de humanos do banco de células ATCC.
2. Sementes 1 x 10⁶ células 143B em 10 mL de meio MEM contendo FBS a 10%, penicilina a 100 U/mL e estreptomicina a 100 μg/mL em placa de cultura celular de 10 cm.
3. Cultivar células 143B a 37 °C em estufa de 5% CO₂ até que as células estejam 80%-90% confluentes.

4. Métodos de modelagem

1. Coletar as células 143B cultivadas confluentes a 80%, ressuspender em 6 mL de meio MEM contendo soro a 10% e misturar com gel de matriz de membrana basal na proporção de volume de 1:1 para fazer uma suspensão celular com concentração final de 1 x 10⁷ células/mL.
2. Injetar 10 μL da suspensão celular na tíbia esquerda de cada camundongo atímico para estabelecer um modelo de xenoenxerto osteossarcoma in situ em camundongos, conforme descrito em nossa publicação^anterior12. As etapas em resumo são as seguintes.
   1. Lave as células 2x com PBS. Tripsinizar as células com 1,5 mL de tripsina a 0,25% por 3 min. Adicionar 6 mL de meio MEM contendo soro a 10%. Coletar as células em um tubo centrífugo de 15 mL.
   2. Aspirar 20 μL de suspensão celular para a câmara da placa de contagem de células e calcular a concentração celular usando um contador automático de células. Centrifugar as células a 800 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   3. Descarte o sobrenadante com pipeta, ressuspenda o pellet de células em matriz de membrana basal de 8,5 mg/mL e coloque-o sobre gelo.
   4. Anestesiar os camundongos expondo-os a isoflurano a 2% e oxigênio a 98% (fluxo de oxigênio, 2 L/min). Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   5. Realize todo o procedimento em uma área bem ventilada. Antes da injeção de células de osteossarcoma, certifique-se de que cada rato está sob anestesia profunda, tocando suavemente o pé; se o mouse ainda tiver respostas, como contração ou. Aguarde mais tempo se o mouse ainda tiver respostas, como contração ou empurrão, até que essas respostas desapareçam.
   6. Coloque o rato em decúbito dorsal. Segure o tornozelo do rato utilizando o polegar e o indicador e desinfete o local de injeção da tíbia com três rondas alternadas de betadina e zaragatoa com etanol a 70%.
   7. Fixe a agulha a uma seringa de 1 ml e aponte a ponta da agulha para o local de injeção paralelo ao eixo da tíbia. Insira a agulha por via percutânea para fazer um orifício através da plataforma da tíbia em direção à extremidade distal da tíbia.
   8. Carregar a suspensão de células de osteossarcoma previamente colocada sobre gelo em uma seringa de microvolume e substituir a seringa de 1 mL na tíbia pela seringa de microvolume carregada com células de osteossarcoma. Injetar lentamente aproximadamente 10 μL de (1 x 10⁷ células/mL) de suspensão de células de osteossarcoma na tíbia de cada camundongo atímico.
   9. Retire a seringa de microvolume do local de injeção e pressione o local de injeção com o cotonete por cerca de 30 s. Coloque o rato de volta numa gaiola limpa e observe a sua recuperação durante 10 minutos.

5. Preparação da fórmula de decocção da medicina tradicional chinesa para gavagem ( Figura 2)

1. Calcule a dosagem conforme o passo 2.
2. Mergulhe todas as ervas medicinais para decocção, exceto a cara erva Ginseng, em água potável com um nível 3 cm mais alto do que a superfície do medicamento, por 30 min, e então execute a decocção 2x como descrito abaixo.
3. Execute a primeira decocção aquecendo para ferver sobre um fogo forte e, em seguida, aquecendo por 15-25 minutos sobre um fogo leve. Fogo leve refere-se a um calor de baixa potência com temperaturas tipicamente variando de 80 °C a 100 °C, enquanto fogo forte refere-se a um calor de alta potência tipicamente variando de 200 °C a 300 °C.
4. Despeje o líquido de decocção em um recipiente.
5. Execute a segunda decocção aquecendo as ervas medicinais em água potável, com um volume apenas o suficiente para submergir a superfície do medicamento, ferver sobre um fogo forte e, em seguida, aquecer por 15-25 minutos sobre um fogo leve.
6. Deite o líquido de decocção no mesmo recipiente do passo 5.4.
7. Mergulhe e decoct 42 g de Ginseng separadamente, com água potável 3 cm mais alto do que a superfície do medicamento, uma vez que é caro.
8. Execute a primeira decocção de Ginseng embebido aquecendo-o sobre um fogo forte por 60 min.
   Deite o líquido de decocção no mesmo recipiente do passo 5.4.
9. Execute a segunda decocção de Ginseng em água potável com um volume apenas o suficiente para submergir a superfície do medicamento, aquecendo sobre um fogo suave por 40 minutos. Deite o líquido de decocção no mesmo recipiente do passo 5.4.
   NOTA: Os recipientes utilizados para decocção devem ser quimicamente estáveis, como caçarolas (as mais utilizadas na prática clínica), cerâmica, vidro e aço inoxidável para evitar possíveis reações químicas com as substâncias medicinais. Todo o líquido de decocção obtido a partir de etapas diferentes deve ser colocado no mesmo recipiente.
10. Misture e filtre o líquido de decocção usando três camadas de gaze fixadas na boca de um copo medidor com elásticos.
11. Ferva a decocção filtrada em fogo forte em uma panela, depois mude para fogo leve e mantenha o fogo leve até atingir a concentração alvo (um volume final de 84 mL com uma concentração final de 1,5 g/mL).
12. Preparar alíquotas de 21 ml da decocção concentrada de acordo com a dose necessária para administração intragástrica durante 1 semana e armazenar as alíquotas num frigorífico a -20 °C.

6. Administração de gavagem em camundongos usando um dispositivo de gavagem

1. Coloque o mouse na superfície da gaiola do mouse ou outra superfície mais áspera.
2. Segure a cauda do rato com o polegar e o indicador da mão direita. Em seguida, segure o pescoço do mouse com o polegar, o indicador e o dedo médio da mão esquerda.
3. Segure a cauda do mouse com os outros dois dedos da mão esquerda para fazer a cabeça, o pescoço e o corpo do mouse em linha reta.
   NOTA: Certifique-se de manter o mouse relaxado durante todo o processo de preensão. Se o mouse continuar lutando para se mover, o processo de preensão deve ser realizado até que o mouse esteja relaxado.
4. Segure o dispositivo de gavagem na mão direita e carregue 200 μL de fórmula de decocção para um rato com 20 g de peso corporal (100 μL de fórmula de decocção/10 g de peso corporal do rato).
5. Insira a agulha de gavagem na boca a partir do canto e empurre a língua contra a mandíbula superior do rato.
6. Mantenha o corpo do rato na mesma direção e empurre suavemente a agulha de gavagem em direção ao estômago ao longo do esôfago até que cerca de 10 mm da agulha de gavagem seja deixada do lado de fora.
   NOTA: Há uma sensação de vazio quando a agulha de gavagem entra no esôfago. O comprimento da agulha de gavagem inserida no rato deve ser medido até ao topo do esterno. O comprimento total da agulha de gavagem é de 60 mm (Figura 3), portanto, cerca de 50 mm da agulha de gavagem devem ser inseridos no corpo do camundongo antes que a fórmula de decocção seja injetada no estômago do camundongo.
7. Injete a fórmula de decocção no estômago do mouse. Encontrar resistência ou líquido saindo do canto da boca significa o deslocamento da agulha de gavagem, que deve ser evitado. Além disso, a velocidade de injeção deve ser diminuída se a fórmula de decocção for espessa.
8. Solte o mouse e observe-os por 10 min. A gavagem é bem-sucedida se nenhuma anormalidade respiratória for observada e retornar o camundongo para a gaiola (Figura 4).

7. Curso do tratamento

1. Para explorar a eficácia terapêutica da decocção Yiqi Jiedu, crie um grupo de controle e um grupo de decocção Yiqi Jiedu. Para os camundongos do grupo controle, administrar soro fisiológico, uma vez ao dia, durante 28 dias. Para ratos no grupo de decocção Yiqi Jiedu, administrar a decocção Yiqi Jiedu uma vez por dia durante 28 dias.

8. Reações adversas

1. Observe atentamente o status dos ratos depois de serem colocados de volta na gaiola, incluindo perda de peso e diminuição do estado mental devido à incapacidade de alimentos entrarem no estômago.
2. Os ratos experimentarão dificuldade em respirar e falta de ar devido à obstrução traqueal causada por alimentos e tossirão na tentativa de limpar a traqueia. Se algum desses sintomas for observado durante a gavagem, pare imediatamente a gavagem e eutanasie os camundongos.

Resultados

O efeito inibitório da decocção de Yiqi Jiedu sobre o crescimento de osteossarcoma in vivo foi determinado em um modelo de xenoenxerto intra-tibial de camundongo osteossarcoma, que foi preparado injetando as células do osteossarcoma 143B na tíbia de camundongos atímicos. A decocção Yiqi Jiedu foi administrada aos camundongos do grupo Yiqi Jiedu por gavagem por 28 dias a partir do segundo dia da injeção de 143B. Solução salina fisiológica foi administrada aos camundongos do grupo controle. Todos os c...

Discussão

A eficácia clínica das ervas prescritas na medicina tradicional chinesa está amplamente associada com a dose administrada e forma de dosagem; Portanto, o estabelecimento de uma estratégia padronizada de decocção e um processo de administração habilidoso são necessários na prática clínica, bem como na melhoria da confiabilidade dos resultados experimentais.

Neste estudo, nós primeiro fornecemos uma estratégia detalhada para a decocção padronizada de ervas chinesas usadas na prá...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
143B cell line	ATCC	CRL-8303	osteosarcoma cell line
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd	R500IP	The Equipment of Anesthesia mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	Animal
Barbed skullcap herb	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	20230606	Decoction-ready medicines
Basement Membrane Matrix	Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd	356234, BD, Matrigel	re-suspende cells
Centrifuge tube (15 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm)	RWD Life Science Co., Ltd.	C21014-12	Component of gastric perfusion device
Gauze	Haishi Hainuo Group Co., Ltd.	LC45	Decoction filter
Ginseng	Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.	20220704-2	Decoction-ready medicines
Hedyotis diffusa	Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd.	2023071107	Decoction-ready medicines
isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	Anesthesia mice
Micro-volume syringe	Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd	0-50 μL	Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	wash the human osteosarcoma cells
Rubber bands	Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd.	XPJ	Fixing gauze on the measuring cup
Syringe (1 mL )	Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd.	SBM0040	Component of gastric perfusion device
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells