A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس والذي يتيح تشخيص السرطان في نقطة الرعاية من خلال التحليل خارج الجسم الحي لأنشطة الأنزيم البروتيني المرتبطة بالورم.

Abstract

وقد مكن إنشاء مؤشرات حيوية اصطناعية لتطوير التشخيص الدقيق من الكشف عن المرض من خلال مسارات تتجاوز تلك المستخدمة في قياسات السوائل الحيوية التقليدية. تستخدم المؤشرات الحيوية الاصطناعية عموما المراسلين الذين يقدمون إشارات قابلة للقراءة في السائل الحيوي لتعكس التغيرات الكيميائية الحيوية في البيئة المكروية المحلية للمرض أثناء حدوث المرض وتطوره. يعد التركيز الدوائي للمراسلين والتضخيم الكيميائي الحيوي لإشارة المرض أمرا بالغ الأهمية لتحقيق حساسية وخصوصية عالية في الاختبار التشخيصي. هنا ، يتم بناء منصة تشخيص السرطان باستخدام شكل واحد من المؤشرات الحيوية الاصطناعية: أجهزة استشعار نانوية قائمة على النشاط تحمل مراسلي الحمض النووي المستقر كيميائيا والتي يمكن تحريرها بواسطة التوقيعات المحللة للبروتين الشاذة في البيئة المكروية للورم. يوفر الحمض النووي الاصطناعي كمراسل للمرض إمكانية تعدد الإرسال من خلال استخدامه كرمز شريطي ، مما يسمح بقراءة التوقيعات المحللة للبروتين المتعددة في وقت واحد. يتم الكشف عن مراسلي الحمض النووي الذين يتم إطلاقهم في البول باستخدام نوكلياز كريسبر عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي كريسبر ، والذي بدوره ينتج إشارة فلورية أو لونية عند تنشيط الإنزيم. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء مستشعرات نانوية قائمة على النشاط مشفرة بالحمض النووي ويتم تجسيد تطبيقها في نموذج فأر قبل السريري لسرطان القولون والمستقيم النقيلي. هذا النظام قابل للتعديل بدرجة كبيرة وفقا لبيولوجيا المرض ويولد إشارات مرضية متعددة في وقت واحد ، مما يوفر فهما شاملا لخصائص المرض من خلال عملية طفيفة التوغل تتطلب فقط إدارة أجهزة الاستشعار النانوية ، وجمع البول ، واختبار ورقي يتيح التشخيص في نقطة الرعاية.

Introduction

على الرغم من الجهد الكبير لتحديد المؤشرات الحيوية للورم مثل البروتينات المتساقطة والحمض النووي ، فقد تم إجهاد مجال تشخيص السرطان بسبب وفرتها المنخفضة أو تدهورها السريع في الدورةالدموية 1. كاستراتيجية تكميلية ، تمثل المؤشرات الحيوية الاصطناعية المهندسة بيولوجيا التي تستجيب بشكل انتقائي لميزات المرض لتوليد إشارات مضخمة طرقا جديدة نحو تشخيصات دقيقة ويمكن الوصول إليها 2,3. للمساعدة في الكشف ، تسخر هذه المؤشرات الحيوية الاصطناعية آليات التنشيط المعتمدة على الورم مثل التضخيم الأنزيمي لإنتاج تحليلات مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء4. هنا ، يتم الاستفادة من فئة من الإنز....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مؤسسة المؤلفين. مطلوب مرافق رعاية القياسية بما في ذلك غرف السكن ، والأغطية المعقمة ، والتخدير ، والقتل الرحيم الأخلاقي لنقطة النهاية لإجراء هذه التجارب بشكل صحيح. يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية ويشرف عليها الطاقم البيطري في المؤسسة. تم الحصول على إناث الفئران BALB / c ، المستخدمة في التجارب ، من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) وتراوحت أعمارها من 6 إلى 8 أسابيع في بداية الدراسة. وترد في الجدول التكميلي 1 تسلسلات الحمض النووي المركب حسب الطلب، والحمض النووي الريبوزي الريبوزي (crRNA)، ومجسات الركيزة الببتيدية القائمة على ال....

النتائج

ترشيح ركائز الببتيد المنشط بالبروتياز
لتصميم أجهزة استشعار تعكس التغيرات في النشاط المحلل للبروتين للأنسجة ، يتم تمييز نشاط الأنزيم البروتيني في الأنسجة أولا باستخدام مكتبة من مجسات الببتيد13 (الشكل 1). يمكن أن توفر عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة م.......

Discussion

تظهر هنا منصة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة للكشف عن السرطان متعدد الإرسال مع اختبار بول محمول يقيم النشاط المحلل للبروتين المرتبط بالمرض باستخدام مستشعر حقن طفيف التوغل. عند تنشيطه بواسطة البروتياز الورمي ، يتم تضخيم انقسام الركيزة الببتيد عن طريق إطلاق الباركود DNA في البول. يمكن قراءة.......

Disclosures

S.N.B. ، L.H. ، و R.T.Z. مدرجة كمخترعين في طلب براءة يتعلق بمحتوى هذا العمل. تمتلك S.N.B. أسهما في Glympse Bio و Satellite Bio و Lisata Therapeutics و Port Therapeutics و Intergalactic Therapeutics و Matrisome Bio وهي مديرة في Vertex. يقدم استشارات لشركة Moderna ، ويتلقى تمويلا بحثيا برعاية من Johnson &Johnson و Revitope و Owlstone.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة دعم معهد كوخ رقم P30-CA14051 من المعهد الوطني للسرطان (مركز سوانسون للتكنولوجيا الحيوية) ، ومنحة المركز الأساسية P30-ES002109 من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية ، ومركز الرخام لمعهد كوخ للطب النانوي للسرطان ، وبرنامج أبحاث معهد كوخ الحدودي عبر صندوق كاثي وكيرت ماربل لأبحاث السرطان ، وصندوق فرجينيا ودي كي لودفيج لأبحاث السرطان. يتم دعم A.E.V.H. من خلال زمالة تدريب ما قبل الدكتوراه الممولة من المعاهد الوطنية للصحة (T32GM130546). S.N.B. هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. يتم دعم L.H. بجائزة K99 / R00 Pathway to Independence من المعهد الوطني للسرطان وتمويل بدء التشغيل من جامعة بوسطن.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x NEB Buffer 2.1New England BiolabsB6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO groupIDTCustom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column AgilentHPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)GE HealthcareFPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)EMD milliporeVarious volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteineCPC ScientificCustom peptide
crRNAs IDTSee Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopyJEM-2100FJEOLcyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugatesCPC ScientificCustom peptide
Dynamic light scattering (DLS)DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µMNew England BiolabsM0653T
Experimental animalsTaconic BiosciencesBALB/cAnNTac6–8 weeks of age
gentleMACS C tubesMiltenyi Biotec130-093-237tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay KitMiltenyi BiotecMGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry BrukerMicroflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell lineKenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive groupJenKemA10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA ReagentInvitrogenO11492ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substratesIDTCustom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL columnGE HealthcareGE28-9909-44For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate readerTecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225

References

  1. Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
  2. Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved