اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس للتشخيص المحمول

Summary

يصف هذا البروتوكول اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس والذي يتيح تشخيص السرطان في نقطة الرعاية من خلال التحليل خارج الجسم الحي لأنشطة الأنزيم البروتيني المرتبطة بالورم.

Abstract

وقد مكن إنشاء مؤشرات حيوية اصطناعية لتطوير التشخيص الدقيق من الكشف عن المرض من خلال مسارات تتجاوز تلك المستخدمة في قياسات السوائل الحيوية التقليدية. تستخدم المؤشرات الحيوية الاصطناعية عموما المراسلين الذين يقدمون إشارات قابلة للقراءة في السائل الحيوي لتعكس التغيرات الكيميائية الحيوية في البيئة المكروية المحلية للمرض أثناء حدوث المرض وتطوره. يعد التركيز الدوائي للمراسلين والتضخيم الكيميائي الحيوي لإشارة المرض أمرا بالغ الأهمية لتحقيق حساسية وخصوصية عالية في الاختبار التشخيصي. هنا ، يتم بناء منصة تشخيص السرطان باستخدام شكل واحد من المؤشرات الحيوية الاصطناعية: أجهزة استشعار نانوية قائمة على النشاط تحمل مراسلي الحمض النووي المستقر كيميائيا والتي يمكن تحريرها بواسطة التوقيعات المحللة للبروتين الشاذة في البيئة المكروية للورم. يوفر الحمض النووي الاصطناعي كمراسل للمرض إمكانية تعدد الإرسال من خلال استخدامه كرمز شريطي ، مما يسمح بقراءة التوقيعات المحللة للبروتين المتعددة في وقت واحد. يتم الكشف عن مراسلي الحمض النووي الذين يتم إطلاقهم في البول باستخدام نوكلياز كريسبر عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي كريسبر ، والذي بدوره ينتج إشارة فلورية أو لونية عند تنشيط الإنزيم. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء مستشعرات نانوية قائمة على النشاط مشفرة بالحمض النووي ويتم تجسيد تطبيقها في نموذج فأر قبل السريري لسرطان القولون والمستقيم النقيلي. هذا النظام قابل للتعديل بدرجة كبيرة وفقا لبيولوجيا المرض ويولد إشارات مرضية متعددة في وقت واحد ، مما يوفر فهما شاملا لخصائص المرض من خلال عملية طفيفة التوغل تتطلب فقط إدارة أجهزة الاستشعار النانوية ، وجمع البول ، واختبار ورقي يتيح التشخيص في نقطة الرعاية.

Introduction

على الرغم من الجهد الكبير لتحديد المؤشرات الحيوية للورم مثل البروتينات المتساقطة والحمض النووي ، فقد تم إجهاد مجال تشخيص السرطان بسبب وفرتها المنخفضة أو تدهورها السريع في الدورة^{الدموية 1}. كاستراتيجية تكميلية ، تمثل المؤشرات الحيوية الاصطناعية المهندسة بيولوجيا التي تستجيب بشكل انتقائي لميزات المرض لتوليد إشارات مضخمة طرقا جديدة نحو تشخيصات دقيقة ويمكن الوصول إليها ^2,3. للمساعدة في الكشف ، تسخر هذه المؤشرات الحيوية الاصطناعية آليات التنشيط المعتمدة على الورم مثل التضخيم الأنزيمي لإنتاج تحليلات مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء⁴. هنا ، يتم الاستفادة من فئة من الإنزيمات المرتبطة بالسرطان ، البروتياز ، لتنشيط أجهزة الاستشعار النانوية القابلة للحقن لإطلاق مراسلي الأمراض الذين يمكن اكتشافهم من السوائل الحيوية مثل الدم أو البول ^5,6. في ضوء عدم تجانس الورم ، يسمح تطوير لوحة من أجهزة الاستشعار التي يتم تنشيطها بالبروتياز بإجراء اختبارات متعددة التحليلات تجمع بين أحداث انقسام البروتياز المختلفة في "توقيع المرض" لتقييم حدوث السرطان وتطوره بطريقة أكثر تحديدا ومتعددة.

تم تطوير المؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز والتي تشتمل على ركائز الببتيد المترافقة على سطح حامل خامل⁷. عند حقنها في الجسم الحي ، يتم نقل هذه الببتيدات إلى الورم حيث يقوم الانقسام الأنزيمي بواسطة البروتياز السرطاني بإطلاق المراسلين في الدم أو البول للكشف عنهم. يتطلب الكشف المتعدد باستخدام المؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز أن يتم تمييز كل علامة حيوية اصطناعية داخل كوكتيل برمز شريطي جزيئي فريد. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير مناهج مختلفة ، بما في ذلك الرموز الشريطية الجماعية والمراسلين المشفرين^{بالليجند 8،9،10}. على عكس طرق تعدد الإرسال هذه التي قد تقتصر على عدد قليل من إمكانيات الإشارة المختلفة ، يوفر التشفير الشريطي للحمض النووي العديد من المجموعات وفقا للتعقيد العالي وعدم التجانس لحالات الأمراض البشرية. لتوسيع تعدد إرسال المؤشرات الحيوية الاصطناعية ، يتم ترميز المستشعرات عن طريق تسمية كل مراسل بتسلسل فريد من الحمض النووي للكشف عبر نوكلياز CRISPR-Cas لتضخيم إشارة الموائع الحيوية خارج الجسم الحي. تم تصميم هذه الرموز الشريطية أحادية الحمض النووي (ssDNA) لترتبط بالحمض النووي الريبي المكمل لكريسبر (crRNAs) ، مما ينشط نشاط النيوكلياز الجانبي الذي يسببه الهدف ل CRISPR-Cas12a¹¹. يمكن استخدام نشاط النيوكلياز هذا لشق شريط الحمض النووي للمراسل المكتشف من خلال حركية التألق أو باستخدام شرائط الورق.

بالإضافة إلى التضخيم الجزيئي عبر البروتياز (في الجسم الحي) و CRISPR-Cas (خارج الجسم الحي) ، تتضمن ميزة التصميم الرئيسية الأخرى للمؤشرات الحيوية الاصطناعية المنشطة بالبروتياز تسخير الحرائك الدوائية للمواد النانوية لزيادة تركيز الإشارة التشخيصية في السوائل الحيوية¹⁰. يتمثل أحد الأساليب في استخدام حامل الجسيمات النانوية لزيادة وقت دوران ركائز الببتيد المقترنة السطحية. يتم اختيار شجيرة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كحامل نانوي بقطر هيدروديناميكي صغير نسبيا وتعدد التكافؤ لزيادة التوصيل إلى الأورام. على الرغم من صغر حجمها بما يكفي لتعزيز توصيل الورم ، إلا أن حجم حامل PEG أكبر من قطع حجم ~ 5 نانومتر لحاجز الترشيح الكبيبي الكلوي بحيث يمكن إزالة ركائز الببتيد المشقوقة فقط في البول ، مع الاستفادة من ترشيح الحجم بواسطة الكلى¹². في هذا البروتوكول ، تم تحديد سير العمل متعدد الخطوات لتوليف وتطبيق أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفر بالحمض النووي في نموذج الفئران قبل السريري ، مما يسلط الضوء على إعداد اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة CRISPR-Cas ، والذي تم استخدامه من قبل هذه المجموعة لتصنيف حالة المرض في نماذج الفئران لأنواع متعددة من السرطان¹³. نظرا لمبدأ التصميم متعدد الاستخدامات ، يمكن تبادل جميع المكونات الوظيفية الثلاثة للمستشعر النانوي - الناقل النانوي (بوليمر PEG) ، والوحدة المستجيبة للمحفزات (الركيزة المنشطة بالبروتياز) ، ومراسل الموائع الحيوية (الباركود DNA) - بدقة وفقا للاحتياجات الخاصة بالتطبيق ، مما يسمح بالنمطية من خلال تكييف خصائص الهدف والإطلاق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مؤسسة المؤلفين. مطلوب مرافق رعاية القياسية بما في ذلك غرف السكن ، والأغطية المعقمة ، والتخدير ، والقتل الرحيم الأخلاقي لنقطة النهاية لإجراء هذه التجارب بشكل صحيح. يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية ويشرف عليها الطاقم البيطري في المؤسسة. تم الحصول على إناث الفئران BALB / c ، المستخدمة في التجارب ، من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) وتراوحت أعمارها من 6 إلى 8 أسابيع في بداية الدراسة. وترد في الجدول التكميلي 1 تسلسلات الحمض النووي المركب حسب الطلب، والحمض النووي الريبوزي الريبوزي (crRNA)، ومجسات الركيزة الببتيدية القائمة على الحوت النقطي، وببتيدات المستشعر.

1. اختيار الركيزة الببتيد المنشط بالبروتياز

1. جمع وإعداد عينات الأنسجة من أنسجة الرئة أو الرئة السليمة مع عقيدات الورم بعد تقرير نشر^{سابقا 13}.
   1. تجانس الأنسجة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS ، درجة الحموضة 7.4) (200 مجم من الأنسجة / مل PBS) مع أنابيب تفكك الأنسجة للتفكك الآلي للأنسجة إلى معلقات أحادية الخلية.
   2. تجانس أنسجة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتفظ بالمادة الطافية في أنبوب جديد.
   3. جهاز طرد مركزي طاف عند 14000 × جم لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   4. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين بحمض البيسينتشونينيك (BCA) (انظر جدول المواد).
   5. أضف برنامج تلفزيوني إلى العينة لتحضير محلول 0.33 ملغم / مل.
2. قم بتقييم النشاط المحلل للبروتين باتباع الخطوات أدناه.
   1. في صفيحة 384 بئرا ، أضف 5 ميكرولتر ، 6 ميكرومتر من مجسات الركيزة الببتيد القائمة على FRET إلى كل بئر. لكل مسبار ، قم بإجراء التفاعل في ثلاث نسخ.
      ملاحظة: يحتوي مسبار الركيزة الببتيد القائم على الحنق على تسلسل ببتيد قصير (6-8 أحماض أمينية ، مصممة لتكون خاصة بالبروتياز المستهدف أو مجموعة من البروتياز) تنتهي بزوج من الفلوروفور والمروي. تم وصف مجسين FRET في الجدول التكميلي 1 كمثال. يمكن العثور على المكتبة الكاملة للتحقيقات في Hao et al.¹³.
   2. أجهزة الطرد المركزي لوحة البئر لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة عند 180 × جم لضمان وجود المجسات في الجزء السفلي من اللوحة.
   3. أضف 25 ميكرولتر 0.33 مجم / مل عينة أنسجة أو 40 ميكرومتر بروتياز مؤتلف¹³ إلى كل بئر.
      ملاحظة: قد يلزم تحسين التركيز النهائي لعينة الأنسجة أو البروتياز المؤتلف وفقا لنشاطهما المحلل للبروتين الداخلي. على سبيل المثال ، قد تتطلب الأنسجة المحللة للبروتين مثل الأمعاء عوامل تخفيف أعلى للسماح بمراقبة الانقسام الأنزيمي الأولي.
   4. أجهزة الطرد المركزي لوحة البئر لفترة وجيزة في 180 × غرام (في درجة حرارة الغرفة) لخلط المجسات و lysates الأنسجة.
   5. ابدأ فورا في اكتشاف انشقاق المسبار عن طريق قياس التألق باستخدام قارئ اللوحة عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة 1 ساعة (λ_{على سبيل المثال}: 485 نانومتر ؛ λ_em: 535 نانومتر) لمراقبة الانقسام.
      ملاحظة: استخدم الأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث لأزواج الفلوروفور والتبريد المحددة. في حالة هذه الدراسة ، تم تعيين المعلمات (λ_{على سبيل المثال}: 485 نانومتر و λ_em: 535 نانومتر) لفلوروفور FAM.
   6. لتحليل بيانات قياس الفلورسنت ، استخدم حزمة Python (انظر جدول المواد) لتحليل حركية الإنزيم المتاح في https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. يحسب هذا البرنامج النصي سرعة التفاعل الأولي (V₀) باستخدام ميل الملاءمة الخطية لأول 8-10 نقاط زمنية أولية.

2. صياغة المستشعر والتوصيف

1. توليف اقتران الحمض النووي والببتيد المنشط بالبروتياز (PAP).
   1. احتضان مراسلي الحمض النووي الفسفوري 20 مير مع مجموعة 3'-DBCO (1.1 مكافئ ، انظر جدول المواد) مع PAPs المنتهية بالأزيد مع نهاية السيستين C-terminus في 100 mM فوسفات عازلة (درجة الحموضة 7.0) في درجة حرارة الغرفة لمدة >4 ساعة. في حالة المغادرة طوال الليل ، احتضان عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بتنقية المنتج على نظام كروماتوغرافيا سائلة عالي الأداء (HPLC) مزود بعمود مثالي للجزيئات الحيوية (انظر جدول المواد). اضبط تدرج HPLC ليبدأ من 5٪ A buffer (0.05٪ TFA في H₂O) ، وحافظ على متساوي القراط لمدة 20 دقيقة ، ووصل إلى 80٪ B buffer (0.05٪ TFA ، 99.95٪ acetonitrile) عند 65 دقيقة بمعدل تدفق 0.3 مل ^min-1 ، واجمع المنتج المترافق مع وقت الاحتفاظ عند ~ 31 دقيقة.
   3. التحقق من صحة الاتحادات المنقاة بواسطة مطياف الكتلة بالليزر بمساعدة المصفوفة / وقت التأين للطيران (MALDI-TOF) باستخدام حمض α-cyano-4-hydroxycinnamic كمصفوفة¹⁴ (انظر جدول المواد).
2. توليف أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفرة بالحمض النووي.
   1. قم بإذابة 2 ملغ من PEG متعدد التكافؤ (40 كيلو دالتون ، 8 أذرع ، انظر جدول المواد) مع مجموعة تفاعل ماليميد في 1 مل من 100 مللي متر فوسفات عازلة (درجة الحموضة 7.0) ومرشح (قطع: 0.2 ميكرومتر).
   2. أضف اتحادات ببتيد الحمض النووي المنتهي بالسيستين (2 مكافئ ، انظر جدول المواد) إلى PEG وتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة >4 ساعات. في حالة المغادرة طوال الليل ، احتضان عند 4 درجات مئوية.
   3. قم بإزالة المواد غير المقترنة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع عمود مصفوفة مركب ديكستران - أغاروز متاح تجاريا على كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) (انظر جدول المواد). قم بتشغيل العينات في PBS ومراقبة الامتصاص عند 260 نانومتر للحمض النووي و 280 نانومتر للببتيد.
   4. ركز المستشعرات النانوية المركبة بأنابيب ترشيح الطرد المركزي (MWCO = 10 كيلو دالتون) وفقا للسرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   5. حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مجموعة مقايسة ssDNA (انظر جدول المواد) وقارئ لوحة عند λ_{على سبيل المثال}: 485 نانومتر و λ_em: 535 نانومتر. قم بتخزين المستشعرات النانوية في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. توصيف أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على النشاط المشفرة بالحمض النووي.
   1. قياس حجم الجسيمات الهيدروديناميكية لأجهزة الاستشعار النانوية المشفرة بالحمض النووي عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
      ملاحظة: نطاق الحجم المتوقع لأجهزة الاستشعار النانوية هو 15-50 نانومتر ، بمتوسط حجم 20-30 نانومتر. إذا كانت هناك رغبة في نطاق حجم محدود ، يمكن استخدام FPLC (في الخطوة 2.3) لعزل الكسور الأضيق ذات الأوزان الجزيئية المختلفة.
   2. ركز المستشعرات النانوية إلى 0.5 مجم / مل (حسب تركيز الحمض النووي) باستخدام أنابيب مرشح الطرد المركزي (MWCO = 10 كيلو دالتون) وقم بتحميل العينات على شبكة نحاسية مغلفة بغشاء الكربون مثبتة على حامل تبريد. راقب التشكل باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ المبرد (200 كيلو فولت ، تكبير 10000-60000)¹⁴.

3. حقن الاستشعار وجمع البول

1. جمع البول لقياس خط الأساس.
   1. ضع الماوس في غرفة سكن مخصصة (انظر الشكل التكميلي 1) مع لوحة 96 بئرا كقاعدة.
   2. قم بتقييد الماوس واضغط برفق على المثانة لإفراغ أي بول متبقي على اللوحة.
   3. ماصة البول الذي تم جمعه (~ 100-200 ميكرولتر) من لوحة 96 بئر في أنبوب 1.5 مل بعد استبدال الماوس إلى السكن الطبيعي.
2. إنشاء نموذج ورم الفئران قبل السريرية.
   1. تلقيح إناث الفئران BALB / c البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع عن طريق الحقن في الوريد بخط خلايا MC26-Fluc الذي يعبر عن luciferase (100 ألف خلية / فأر) (انظر جدول المواد). راقب تطور الورم أسبوعيا باستخدام نظام التصوير الفلوري في الجسم الحي .
      ملاحظة: يحدث عبء الورم المرئي المشار إليه بإشارة الإنارة تقريبا في الأسبوع 2 من حقن خط الخلية هذا. تحقق بعناية من الحاملة للورم أثناء تطور الورم على أساس منتظم.
3. حقن أجهزة الاستشعار النانوية في نقاط زمنية مختلفة بعد زرع الورم.
   1. تحضير محلول حقن (200 ميكرولتر كحد أقصى) يحتوي على مستشعرات نانوية بتركيز 1 نانومول بواسطة الباركود DNA في PBS المعقم.
   2. حقن محلول مستشعر 200 ميكرولتر في PBS في كل فأر تجريبي عن طريق الوريد.
4. اجمع عينات البول من الفئران الضابطة السليمة والفئران الحاملة للورم في ساعة واحدة بعد حقن المستشعر كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.3.
   ملاحظة: يمكن معالجة عينات البول الطازجة لتحليل الباركود الحمض النووي مباشرة أو تجميدها على الفور على الجليد.

4. كشف كريسبر للرموز الشريطية للحمض النووي: قائم على التألق

1. استخدم عينات البول الطازجة أو تذويب العينات المجمدة على الجليد. عينات بول الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. ادمج الكواشف في الجدول التكميلي 2 ، وأضف إنزيم Cas12a (انظر جدول المواد) أخيرا واخلط التفاعل برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. قم بتشغيل رد فعل المراسل ، كما هو موضح في الجدول التكميلي 3 ، في ثلاث نسخ باستخدام حاصل ضرب الخطوة 2. أضف رد الفعل من الخطوة 2 أخيرا وانقله بسرعة إلى قارئ اللوحة.
4. اكتشف تنشيط LbaCas12a عن طريق قياس التألق باستخدام قارئ لوحة عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة 3 ساعات (λ_{على سبيل المثال}: 485 نانومتر و λ_em: 535 نانومتر) لمراقبة حركية الانقسام لمراسل الحمض النووي.
5. لتحليل بيانات قياس الفلورسنت ، استخدم حزمة Python لتحليل حركية الإنزيم المتوفرة في https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. يحسب هذا البرنامج النصي سرعة التفاعل الأولي (V₀) باستخدام ميل الملاءمة الخطية لأول 8-10 نقاط زمنية أولية.

5. كشف كريسبر للرموز الشريطية للحمض النووي: الورقي

1. عينات بول الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: قم بتشغيل عينات البول للكشف عن كريسبر القائم على التألق والورقي بالتوازي.
2. الجمع بين الكواشف في الجدول التكميلي 2. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: خطوة الحضانة هذه مطابقة لتلك الخاصة باكتشاف كريسبر القائم على التألق.
3. قم بتشغيل رد فعل المراسل باستخدام مراسل الحمض النووي المسمى FAM-biotin لمقايسة التدفق الجانبي على شريط ورقي (انظر جدول المواد). اجمع الكواشف في الجدول التكميلي 4 في صفيحة من 96 بئرا باستخدام ناتج الخطوة 2. يغطى بورق الألمنيوم ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: حدد وقت الحضانة الأمثل وفقا لمراقبة الحركية في الوقت الفعلي في اختبار الكشف عن كريسبر القائم على التألق الموصوف أعلاه.
4. إلى بئر جديد من صفيحة 96 بئرا ، أضف 80 ميكرولتر من PBS. أضف 20 ميكرولتر من العينة من الخطوة 3 إلى هذا البئر.
5. ضع شريطا ورقيا جانبيا للتدفق على كل بئر وانتظر حتى يصل السائل إلى أعلى الشريط (<5 دقيقة). ابحث عن مظهر شريط (أربطة) التحكم و/أو العينة على شريط الورق.
6. التقط صورة لشريط التدفق الجانبي وحدد شدة النطاق باستخدام ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ترشيح ركائز الببتيد المنشط بالبروتياز
لتصميم أجهزة استشعار تعكس التغيرات في النشاط المحلل للبروتين للأنسجة ، يتم تمييز نشاط الأنزيم البروتيني في الأنسجة أولا باستخدام مكتبة من مجسات الببتيد¹³ (الشكل 1). يمكن أن توفر عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تظهر هنا منصة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة للكشف عن السرطان متعدد الإرسال مع اختبار بول محمول يقيم النشاط المحلل للبروتين المرتبط بالمرض باستخدام مستشعر حقن طفيف التوغل. عند تنشيطه بواسطة البروتياز الورمي ، يتم تضخيم انقسام الركيزة الببتيد عن طريق إطلاق الباركود DNA في البول. يمكن قراءة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225