اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس للتشخيص المحمول

Summary

يصف هذا البروتوكول اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس والذي يتيح تشخيص السرطان في نقطة الرعاية من خلال التحليل خارج الجسم الحي لأنشطة الأنزيم البروتيني المرتبطة بالورم.

Abstract

وقد مكن إنشاء مؤشرات حيوية اصطناعية لتطوير التشخيص الدقيق من الكشف عن المرض من خلال مسارات تتجاوز تلك المستخدمة في قياسات السوائل الحيوية التقليدية. تستخدم المؤشرات الحيوية الاصطناعية عموما المراسلين الذين يقدمون إشارات قابلة للقراءة في السائل الحيوي لتعكس التغيرات الكيميائية الحيوية في البيئة المكروية المحلية للمرض أثناء حدوث المرض وتطوره. يعد التركيز الدوائي للمراسلين والتضخيم الكيميائي الحيوي لإشارة المرض أمرا بالغ الأهمية لتحقيق حساسية وخصوصية عالية في الاختبار التشخيصي. هنا ، يتم بناء منصة تشخيص السرطان باستخدام شكل واحد من المؤشرات الحيوية الاصطناعية: أجهزة استشعار نانوية قائمة على النشاط تحمل مراسلي الحمض النووي المستقر كيميائيا والتي يمكن تحريرها بواسطة التوقيعات المحللة للبروتين الشاذة في البيئة المكروية للورم. يوفر الحمض النووي الاصطناعي كمراسل للمرض إمكانية تعدد الإرسال من خلال استخدامه كرمز شريطي ، مما يسمح بقراءة التوقيعات المحللة للبروتين المتعددة في وقت واحد. يتم الكشف عن مراسلي الحمض النووي الذين يتم إطلاقهم في البول باستخدام نوكلياز كريسبر عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي كريسبر ، والذي بدوره ينتج إشارة فلورية أو لونية عند تنشيط الإنزيم. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء مستشعرات نانوية قائمة على النشاط مشفرة بالحمض النووي ويتم تجسيد تطبيقها في نموذج فأر قبل السريري لسرطان القولون والمستقيم النقيلي. هذا النظام قابل للتعديل بدرجة كبيرة وفقا لبيولوجيا المرض ويولد إشارات مرضية متعددة في وقت واحد ، مما يوفر فهما شاملا لخصائص المرض من خلال عملية طفيفة التوغل تتطلب فقط إدارة أجهزة الاستشعار النانوية ، وجمع البول ، واختبار ورقي يتيح التشخيص في نقطة الرعاية.

Introduction

على الرغم من الجهد الكبير لتحديد المؤشرات الحيوية للورم مثل البروتينات المتساقطة والحمض النووي ، فقد تم إجهاد مجال تشخيص السرطان بسبب وفرتها المنخفضة أو تدهورها السريع في الدورة^{الدموية 1}. كاستراتيجية تكميلية ، تمثل المؤشرات الحيوية الاصطناعية المهندسة بيولوجيا التي تستجيب بشكل انتقائي لميزات المرض لتوليد إشارات مضخمة طرقا جديدة نحو تشخيصات دقيقة ويمكن الوصول إليها ^2,3. للمساعدة في الكشف ، تسخر هذه المؤشرات الحيوية الاصطناعية آليات التنشيط المعتمدة على الورم مثل التضخيم الأنزيمي لإنتاج تحليلات مع تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء⁴. هنا ، يتم الاستفادة من فئة من الإنز....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في مؤسسة المؤلفين. مطلوب مرافق رعاية القياسية بما في ذلك غرف السكن ، والأغطية المعقمة ، والتخدير ، والقتل الرحيم الأخلاقي لنقطة النهاية لإجراء هذه التجارب بشكل صحيح. يتم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية ويشرف عليها الطاقم البيطري في المؤسسة. تم الحصول على إناث الفئران BALB / c ، المستخدمة في التجارب ، من مصدر تجاري (انظر جدول المواد) وتراوحت أعمارها من 6 إلى 8 أسابيع في بداية الدراسة. وترد في الجدول التكميلي 1 تسلسلات الحمض النووي المركب حسب الطلب، والحمض النووي الريبوزي الريبوزي (crRNA)، ومجسات الركيزة الببتيدية القائمة على ال....

النتائج

ترشيح ركائز الببتيد المنشط بالبروتياز
لتصميم أجهزة استشعار تعكس التغيرات في النشاط المحلل للبروتين للأنسجة ، يتم تمييز نشاط الأنزيم البروتيني في الأنسجة أولا باستخدام مكتبة من مجسات الببتيد¹³ (الشكل 1). يمكن أن توفر عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة م.......

Discussion

تظهر هنا منصة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة للكشف عن السرطان متعدد الإرسال مع اختبار بول محمول يقيم النشاط المحلل للبروتين المرتبط بالمرض باستخدام مستشعر حقن طفيف التوغل. عند تنشيطه بواسطة البروتياز الورمي ، يتم تضخيم انقسام الركيزة الببتيد عن طريق إطلاق الباركود DNA في البول. يمكن قراءة.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225