JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

Abstract

יצירת סמנים ביולוגיים סינתטיים לפיתוח אבחון מדויק אפשרה זיהוי מחלות דרך מסלולים מעבר לאלה המשמשים למדידות ביו-נוזליות מסורתיות. סמנים ביולוגיים סינתטיים בדרך כלל עושים שימוש בכתבים המספקים אותות קריאים בנוזל הביולוגי כדי לשקף את השינויים הביוכימיים במיקרו-סביבה המקומית של המחלה במהלך היארעות המחלה והתקדמותה. הריכוז הפרמקוקינטי של המדווחים וההגברה הביוכימית של אות המחלה הם בעלי חשיבות עליונה להשגת רגישות גבוהה וספציפיות בבדיקת אבחון. כאן, פלטפורמה לאבחון סרטן בנויה באמצעות פורמט אחד של סמנים ביולוגיים סינתטיים: ננו-חיישנים מבוססי פעילות הנושאים כתבי DNA מיוצבים כימית שניתן לשחרר על ידי חתימות פרוטאוליטיות חריגות במיקרו-סביבה של הגידול. דנ"א סינתטי כמדווח מחלות מעניק יכולת ריבוב באמצעות השימוש בו כברקוד, המאפשר קריאה של חתימות פרוטאוליטיות מרובות בבת אחת. כתבי דנ"א המשוחררים לשתן מזוהים באמצעות נוקלאזות CRISPR באמצעות הכלאה עם RNA קריספר, אשר בתורו מייצרים אות פלואורסצנטי או קולורימטרי בעת הפעלת האנזים. בפרוטוקול זה נבנים ננו-חיישנים מבוססי פעילות המבוססים על ברקוד DNA ויישומם מודגם במודל עכברי פרה-קליני של סרטן מעי גס גרורתי. מערכת זו ניתנת לשינוי רב על פי הביולוגיה של המחלה ומייצרת אותות מחלה מרובים בו זמנית, מה שמאפשר הבנה מקיפה של מאפייני המחלה בתהליך זעיר פולשני הדורש מתן ננו-חיישנים בלבד, איסוף שתן ובדיקת נייר המאפשרת אבחון נקודתי.

Introduction

למרות המאמץ המשמעותי לזהות סמנים ביולוגיים של גידולים כגון חלבונים שנשפכו ודנ"א, תחום אבחון הסרטן היה מתוח על ידי השפע הנמוך שלהם או השפלה מהירה במחזור הדם1. כאסטרטגיה משלימה, סמנים ביולוגיים סינתטיים מהונדסים ביולוגית המגיבים באופן סלקטיבי לתכונות מחלה כדי ליצור אותות מוגברים מייצגים דרכים חדשות לקראת אבחון מדויק ונגיש 2,3. כדי לסייע בזיהוי, סמנים ביולוגיים סינתטיים אלה רותמים מנגנוני הפעלה תלויי גידול, כגון הגברה אנזימטית, כדי לייצר אנליטים עם יחס אות לרעש משופר4. כאן, קבוצה של אנזימים הקשורים לסרטן, פרוטאזות, ממונפים כדי להפעיל חיישנים ננומטריים הניתנים להזרקה כדי לשחרר מדווחי מחלות הניתנים לזיהוי מהנוזלים הביולוגיים כגון דם או שתן 5,6. לאור ההטרוגניות של הגידול, פיתוח פאנל של חיישנים המופעלים על ידי פרוטאז מאפשר בדיקות מולטיאנליטיות המשלבות אירועי מחשוף פרוטאז שונים לכדי "חתימת מחלה" כדי להעריך היארעות סרטן והתקדמות באופן ספציפי יותר, מרובה.

פותחו סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז המהווים מצעי פפטיד מצומדים לפני השטח של נשא אינרטי7. כאשר הם מוזרקים in vivo, פפטידים אלה נישאים אל הגידול, שם מחשוף אנזימטי על ידי פרוטאזות הגידול משחרר את הכתבים לדם או לשתן לצורך זיהוי. זיהוי מרובב עם סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז דורש שכל סמן ביולוגי סינתטי בתוך קוקטייל יסומן בברקוד מולקולרי ייחודי. לשם כך פותחו גישות שונות, כולל ברקודים המוניים וכתבים מקודדי ליגנד 8,9,10. בניגוד לשיטות אלה של ריבוב אשר עשויות להיות מוגבלות למספר אפשרויות אות שונות, ברקוד DNA מאפשר שילובים רבים יותר בהתאם למורכבות הגבוהה וההטרוגניות של מצבי מחלה אנושיים. כדי להרחיב את הריבוי של סמנים ביולוגיים סינתטיים, החיישנים מקודדים על ידי תיוג כל כתב עם רצף DNA ייחודי לזיהוי באמצעות נוקלאז CRISPR-Cas כדי להגביר את האות הביופלואיד ex vivo. ברקודים אלה של דנ"א חד-גדילי (ssDNA) מתוכננים להיקשר לרנ"א מנחה קריספר משלים (crRNAs), ולהפעיל את פעילות הנוקלאז הבטחוני המופעל על ידי המטרה של CRISPR-Cas12a11. ניתן להשתמש בפעילות נוקלאז זו כדי לבקע גדיל דנ"א של כתב שזוהה באמצעות קינטיקה פלואורסצנטית או באמצעות רצועות נייר.

בנוסף להגברה מולקולרית באמצעות פרוטאזות (in vivo) ו-CRISPR-Cas (ex vivo), מאפיין מרכזי נוסף של סמנים ביולוגיים סינתטיים המופעלים על ידי פרוטאז כרוך ברתימת פרמקוקינטיקה ננו-חומרית להגדלת ריכוז אות האבחון בנוזלים ביולוגיים10. גישה אחת היא שימוש בנשא ננו-חלקיקים כדי להגדיל את זמן הסירקולציה של מצעי פפטיד מצומדים על פני השטח. דנדרימר פוליאתילן גליקול (PEG) נבחר כננו-נשא בעל קוטר הידרודינמי קטן יחסית ורב-ערכיות כדי להגביר את המסירה לגידולים. בעוד שהוא קטן מספיק כדי לקדם את העברת הגידול, גודלו של נשא ה- PEG גדול יותר מהחתך בגודל ~ 5 ננומטר של מחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה, כך שרק מצעי פפטיד שסועים יכולים להתנקות לתוך השתן, תוך ניצול סינון הגודל על ידי הכליות12. בפרוטוקול זה, תהליך העבודה הרב-שלבי מתואר לסינתזה וליישום של ננו-חיישנים מבוססי פעילות ברקוד-DNA במודל מורין פרה-קליני, תוך הדגשת ההתקנה של בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, אשר שימשה קבוצה זו כדי לסווג את מצב המחלה במודלים מורינים של סוגי סרטן מרובים13. הודות לעקרון התכנון הרב-תכליתי, כל שלושת המרכיבים הפונקציונליים של הננו-חיישן - הננו-נשא (פולימר PEG), המודול המגיב לגירויים (מצע המופעל על ידי פרוטאז) והכתב הביופלואיד (ברקוד DNA) - ניתנים להחלפה מדויקת בהתאם לצרכים ספציפיים ליישום, מה שמאפשר מודולריות על ידי התאמת ספציפיות המטרה והשחרור.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד המחברים. מתקנים סטנדרטיים לטיפול בבעלי חיים, כולל תאי דיור, ברדסים סטריליים, הרדמה והמתת חסד אתית נדרשים כדי לבצע ניסויים אלה כראוי. כל הניסויים נערכים בהתאם להנחיות מוסדיות וארציות ובפיקוח הצוות הווטרינרי במוסד. נקבות עכברי BALB/c, המשמשות לניסויים, מתקבלות ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים) וגילן נע בין 6 ל-8 שבועות בתחילת המחקר. רצפים עבור DNA מסונתז בהתאמה אישית, crRNA, בדיקות מצע פפטידי מבוסס FRET, ופפטידים חיישנים מסופקים בטבלה משלימה 1.

1. בחירת מצע פפטידי המופעל על ידי פרוטאז

  1. לאסוף ולהכין דגימות רקמה מרקמת ריאה או ריאה בריאה עם גושים סרטניים בעקבות דוחשפורסם בעבר 13.
    1. הומוגניזציה של רקמות במי מלח חוצצים פוספט מקורר מראש (PBS, pH 7.4) (200 מ"ג רקמה/מ"ל PBS) עם צינורות דיסוציאציה של רקמות לדיסוציאציה אוטומטית של רקמות לתרחיפים חד-תאיים.
    2. רקמת הצנטריפוגה הומוגנטית ב 6,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant בצינור חדש.
    3. צנטריפוגה את supernatant ב 14,000 x גרם במשך 25 דקות ב 4 ° C.
    4. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון של חומצה ביכומונית (BCA) (ראה טבלת חומרים).
    5. הוסף PBS למדגם כדי להכין תמיסת 0.33 מ"ג / מ"ל.
  2. הערך את הפעילות הפרוטאוליטית לפי השלבים הבאים.
    1. בצלחת של 384 בארות, הוסיפו 5 μL, 6 μM מצע פפטידי מבוסס FRET לכל באר. עבור כל בדיקה, לבצע את התגובה משולשת.
      הערה: בדיקת מצע פפטיד מבוססת FRET מכילה רצף פפטידי קצר (6-8 חומצות אמינו, שנועד להיות ספציפי לפרוטאז מטרה או לקבוצת פרוטאזות) המסתיים בזוג פלואורופור ומרווה (quencher). שתי בדיקות FRET מתוארות בטבלה משלימה 1 כדוגמה. את הספרייה המלאה של הגשושיות ניתן למצוא ב- Hao et al.13.
    2. צנטריפוגו את צלחת הבאר במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר ב 180 x גרם כדי להבטיח את הגשושיות בתחתית הצלחת.
    3. הוסף 25 μL 0.33 מ"ג / מ"ל דגימת רקמה או 40 מיקרומטר פרוטאז רקומביננטי13 לכל באר.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את הריכוז הסופי של דגימת הרקמה או הפרוטאז הרקומביננטי בהתאם לפעילות הפרוטאוליטית הפנימית שלהם. לדוגמה, רקמות פרוטאוליטיות מאוד כגון מעיים עשויות לדרוש גורמי דילול גבוהים יותר כדי לאפשר ניטור של שסע אנזימטי ראשוני.
    4. צנטריפוגה את צלחת הבאר לזמן קצר ב 180 x גרם (בטמפרטורת החדר) כדי לערבב את הגשושיות ואת lysates רקמות.
    5. התחל מיד לזהות מחשוף בדיקה על ידי מדידת פלואורסצנטיות עם קורא הלוחות ב 37 ° C כל 2 דקות במשך 1 שעה (λex: 485 ננומטר; λem: 535 ננומטר) כדי לפקח על המחשוף.
      הערה: השתמש באורכי גל העירור והפליטה המתאימים לזוגות פלואורופורים ומרווה ספציפיים. במקרה של מחקר זה, פרמטרים (λex: 485 nm ו- λem: 535 nm) נקבעים עבור פלואורופור FAM.
    6. כדי לנתח את נתוני המדידה הפלואורסצנטיים, השתמש בחבילת Python (ראה טבלת חומרים) לניתוח קינטיקה של אנזימים הזמין ב- https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. סקריפט זה מחשב את מהירות התגובה הראשונית (V0) באמצעות שיפוע ההתאמה הליניארית של 8-10 נקודות הזמן ההתחלתיות הראשונות.

2. ניסוח ואפיון חיישנים

  1. לסנתז את הצמידות של DNA ופפטיד המופעל על ידי פרוטאז (PAP).
    1. לדגור על כתבי DNA פוספורותיו של 20 מר עם קבוצת 3'-DBCO (1.1 eq., ראה טבלת חומרים) עם PAPs עם סיום אזיד עם C-terminus ציסטאין מסתיים במאגר פוספט של 100 mM (pH 7.0) בטמפרטורת החדר למשך >4 שעות. אם עוזבים לילה, לדגור ב 4 °C (75 °F).
    2. לטהר את המוצר על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים המצוידת בטור אידיאלי לביומומולקולות (ראה טבלת חומרים). הגדר את שיפוע HPLC להתחיל ממאגר 5% A (0.05% TFA ב- H2O), לשמור איזוקרטי למשך 20 דקות ולהגיע למאגר 80% B (0.05% TFA, 99.95% אצטוניטריל) ב- 65 דקות עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל min-1, ואסוף את המוצר המצומד עם זמן שמירה ב~ 31 דקות.
    3. אמת את המצומדים המטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסות ספיחה בלייזר/זמן יינון טיסה (MALDI-TOF) בעזרת מטריצה באמצעות חומצה α-ציאנו-4-הידרוקסיצינאמית כמטריצה14 (ראה טבלת חומרים).
  2. סנתז ננו-חיישנים מבוססי פעילות המקודדים בדנ"א.
    1. יש להמיס 2 מ"ג של PEG רב-ערכי (40 kDa, 8-arm, ראו טבלת חומרים) עם קבוצה תגובתית maleimide ב-1 מ"ל של 100 mM חיץ פוספט (pH 7.0) ומסנן (cutoff: 0.2 μm).
    2. הוסף את הצמידות של DNA-פפטיד ציסטאין (2 eq., ראה טבלת חומרים) ל- PEG ולהגיב בטמפרטורת החדר במשך >4 שעות. אם עוזבים לילה, לדגור ב 4 °C (75 °F).
    3. הסר את החומרים הלא מצומדים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עם עמודת מטריצה מרוכבת דקסטרן-אגרוז הזמינה מסחרית על כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר (FPLC) (ראה טבלת חומרים). הפעל דגימות ב- PBS ונטר ספיגה ב- 260 ננומטר עבור DNA ו- 280 ננומטר עבור פפטידים.
    4. רכז את הננו-חיישנים המסונתזים עם צינורות מסנן צנטריפוגליים (MWCO = 10 kDa) בהתאם למהירות המומלצת של היצרן (ראה טבלת חומרים).
    5. כמת את ריכוז הדנ"א באמצעות ערכת בדיקת ssDNA (ראה טבלת חומרים) וקורא לוחות ב- λex: 485 nm ו- λem: 535 nm. אחסן את הננו-חיישנים בטמפרטורה של 4°C.
  3. לאפיין ננו-חיישנים מבוססי פעילות מקודדי DNA.
    1. מדוד את גודל החלקיקים ההידרודינמיים של ננו-חיישנים המקודדים בדנ"א באמצעות פיזור אור דינמי (DLS).
      הערה: טווח הגדלים הצפוי של ננו-חיישנים הוא 15-50 ננומטר, עם גודל ממוצע של 20-30 ננומטר. אם רוצים טווח גדלים מוגבל, ניתן להשתמש ב- FPLC (בשלב 2.3) כדי לבודד שברים צרים יותר עם משקלים מולקולריים שונים.
    2. רכז את הננו-חיישנים ל -0.5 מ"ג / מ"ל (לפי ריכוז DNA) עם צינורות מסנן צנטריפוגליים (MWCO = 10 kDa) וטען את הדגימות על רשת נחושת מצופה סרט פחמן המורכבת על מחזיק קריו. התבונן במורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (200 kV, הגדלה של 10,000-60,000)14.

3. הזרקת חיישנים ואיסוף שתן

  1. יש לאסוף שתן למדידה בסיסית.
    1. הכניסו את העכבר לתא דיור מותאם אישית (ראו איור משלים 1) עם צלחת בת 96 בארות כבסיס.
    2. רסן את העכבר והפעל לחץ עדין על שלפוחית השתן כדי לרוקן את שאריות השתן על הצלחת.
    3. פיפטה את השתן שנאסף (~ 100-200 μL) מן צלחת 96 באר לתוך צינור 1.5 מ"ל לאחר החלפת העכבר לבית רגיל.
  2. הקמת מודל גידול מורין פרה-קליני.
    1. חסן עכברות BALB/c בנות 6 עד 8 שבועות על ידי הזרקה תוך ורידית עם קו תאי MC26-Fluc המבטא לוציפראז (100k תאים / עכבר) (ראה טבלת חומרים). מעקב אחר התקדמות הגידול מדי שבוע באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית in vivo .
      הערה: עומס הגידול הנראה לעין המצוין על ידי אות זוהר מתרחש בערך בשבוע השני של הזרקת קו תאים מסוים זה. בדוק היטב בעלי חיים נושאי גידול במהלך התקדמות הגידול על בסיס קבוע.
  3. הזרקת ננו-חיישנים בנקודות זמן שונות לאחר השתלת הגידול.
    1. הכינו תמיסת הזרקה (נפח מרבי של 200 μL) המכילה ננו-חיישנים בריכוז של 1 nmol על ידי ברקוד DNA ב-PBS סטרילי.
    2. הזריקו תמיסת חיישן 200 μL ב-PBS לכל עכבר ניסיוני תוך ורידי.
  4. יש לאסוף דגימות שתן מעכברי בקרה בריאה ועכברים נושאי גידול בשעה אחת לאחר הזרקת החיישן, כמתואר בשלבים 1.1-1.3.
    הערה: ניתן לעבד דגימות שתן טריות לניתוח ברקוד DNA ישירות או להקפיא מיד על קרח.

4. זיהוי CRISPR של ברקודי DNA: מבוסס פלואורסצנטיות

  1. השתמשו בדגימות שתן טריות או הפשירו דגימות קפואות על קרח. דגימות שתן צנטריפוגות ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 2, הוסף את האנזים Cas12a (ראה טבלת חומרים) אחרון וערבב בעדינות את התגובה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה. לדגור את התגובה ב 37 ° C במשך 30 דקות.
  3. הפעל את תגובת המדווח, כפי שמוצג בטבלה משלימה 3, במשולש באמצעות המכפלה של שלב 2. הוסף את התגובה משלב 2 האחרון והבא במהירות לקורא הלוחות.
  4. זהה הפעלת LbaCas12a על ידי מדידת פלואורסצנטיות עם קורא לוחות ב 37 ° C כל 2 דקות במשך 3 שעות (λex: 485 ננומטר ו λem: 535 ננומטר) כדי לפקח על קינטיקה מחשוף של כתב DNA.
  5. כדי לנתח את נתוני המדידה הפלואורסצנטיים, השתמש בחבילת Python לניתוח קינטיקה של אנזימים הזמין ב- https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. סקריפט זה מחשב את מהירות התגובה הראשונית (V0) באמצעות שיפוע ההתאמה הליניארית של 8-10 נקודות הזמן ההתחלתיות הראשונות.

5. זיהוי CRISPR של ברקודי DNA: מבוסס נייר

  1. דגימות שתן צנטריפוגות ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הפעל את דגימות השתן לזיהוי CRISPR מבוסס פלואורסצנטיות ומבוסס נייר במקביל.
  2. שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    הערה: שלב דגירה זה זהה לזה של זיהוי CRISPR מבוסס פלואורסצנטיות.
  3. הפעל את תגובת הכתב באמצעות כתב FAM-ביוטין המסומן ב- DNA לבדיקת זרימה צידית על רצועת נייר (ראה טבלת חומרים). שלב את הריאגנטים בטבלה משלימה 4 בצלחת של 96 בארות באמצעות המכפלה של שלב 2. מכסים ברדיד אלומיניום ודגרים ב-37°C למשך שעה.
    הערה: בחר את זמן הדגירה האופטימלי בהתאם לניטור קינטיקה בזמן אמת בבדיקת זיהוי CRISPR מבוססת פלואורסצנטיות שתוארה לעיל.
  4. לבאר טרייה של צלחת 96 בארות, להוסיף 80 μL של PBS. הוסף 20 μL של מדגם משלב 3 לבאר זו.
  5. מניחים פס נייר זרימה רוחבי אחד לכל באר וממתינים עד שהנוזל מגיע לחלק העליון של הרצועה (<5 דקות). חפש את המראה של רצועות הבקרה ו/או הדגימה ברצועת הנייר.
  6. צלם תמונה של רצועת הזרימה הצידית וכמת את עוצמת הרצועה באמצעות ImageJ.

תוצאות

מינוי מצעי פפטיד המופעלים על ידי פרוטאז
כדי לתכנן חיישנים שישקפו שינויים בפעילות הפרוטאוליטית של הרקמה, פעילות הפרוטאז ברקמה מאופיינת תחילה באמצעות ספרייה של גשושיות פפטידיות13 (איור 1). דגימות רקמה טריות וקפואות יכולות לספק מידע משמעותי על הפעילות...

Discussion

כאן מוצגת פלטפורמה הניתנת להתאמה אישית רבה לגילוי סרטן מרובה משתתפים עם בדיקת שתן ניידת המעריכה פעילות פרוטאוליטית הקשורה למחלה באמצעות חיישן מוזרק זעיר פולשני. כאשר מופעל על ידי פרוטאזות גידוליות, מחשוף המצע הפפטידי מוגבר באמצעות שחרור ברקוד DNA לתוך השתן. את כתבי הדנ"א הסינתטי בדגי?...

Disclosures

S.N.B., L.H. ו-R.T.Z. רשומים כממציאים בבקשת פטנט הקשורה לתוכן עבודה זו. S.N.B. מחזיקה במניות Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, והיא דירקטורית ב-Vertex; מייעץ למודרנה, ומקבל מימון מחקר ממומן מג'ונסון אנד ג'ונסון, רוויטופ וינשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק תמיכה של מכון קוך מספר P30-CA14051 מהמכון הלאומי לסרטן (מרכז סוונסון לביוטכנולוגיה), מענק מרכז ליבה P30-ES002109 מהמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, מרכז מרבל לננו-רפואה של סרטן במכון קוך, תוכנית מחקר הגבולות של מכון קוך באמצעות קרן קתי וקורט מארבל לחקר הסרטן, וקרן וירג'יניה וד.ק. לודוויג לחקר הסרטן. A.E.V.H. נתמך על ידי מלגת הכשרה קדם-דוקטורנטית במימון NIH (T32GM130546). S.N.B. הוא חוקר במכון הרפואי הווארד יוז. L.H. נתמכת על ידי K99/R00 Pathway to Independence Award מהמכון הלאומי לסרטן ומימון סטארט-אפ מאוניברסיטת בוסטון.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x NEB Buffer 2.1New England BiolabsB6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO groupIDTCustom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column AgilentHPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)GE HealthcareFPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)EMD milliporeVarious volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteineCPC ScientificCustom peptide
crRNAs IDTSee Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopyJEM-2100FJEOLcyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugatesCPC ScientificCustom peptide
Dynamic light scattering (DLS)DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µMNew England BiolabsM0653T
Experimental animalsTaconic BiosciencesBALB/cAnNTac6–8 weeks of age
gentleMACS C tubesMiltenyi Biotec130-093-237tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay KitMiltenyi BiotecMGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry BrukerMicroflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell lineKenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive groupJenKemA10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA ReagentInvitrogenO11492ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substratesIDTCustom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL columnGE HealthcareGE28-9909-44For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate readerTecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225

References

  1. Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
  2. Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
  3. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
  4. Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
  5. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  7. Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
  8. Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
  9. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  10. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
  11. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  12. Choi, H. S., et al. Renal clearance of quantum dots. Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  13. Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
  14. Hao, L., et al. Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics. Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).
  15. Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
  16. Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved