CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Entwicklung synthetischer Biomarker für die Entwicklung von Präzisionsdiagnostika hat die Erkennung von Krankheiten über Wege ermöglicht, die über die für herkömmliche Biofluidmessungen verwendeten hinausgehen. Synthetische Biomarker verwenden im Allgemeinen Reporter, die lesbare Signale in der Bioflüssigkeit liefern, um die biochemischen Veränderungen in der lokalen Krankheitsmikroumgebung während des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit widerzuspiegeln. Die pharmakokinetische Konzentration der Reporter und die biochemische Amplifikation des Krankheitssignals sind von größter Bedeutung, um eine hohe Sensitivität und Spezifität in einem diagnostischen Test zu erreichen. Hier wird eine Krebsdiagnoseplattform mit einem Format synthetischer Biomarker aufgebaut: aktivitätsbasierte Nanosensoren, die chemisch stabilisierte DNA-Reporter tragen, die durch aberrante proteolytische Signaturen in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden können. Synthetische DNA als Krankheitsreporter bietet Multiplexing-Fähigkeit durch ihre Verwendung als Barcode, die das gleichzeitige Auslesen mehrerer proteolytischer Signaturen ermöglicht. DNA-Reporter, die in den Urin freigesetzt werden, werden mit Hilfe von CRISPR-Nukleasen durch Hybridisierung mit CRISPR-RNAs nachgewiesen, die wiederum bei Enzymaktivierung ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal erzeugen. In diesem Protokoll werden DNA-Barcode-basierte, aktivitätsbasierte Nanosensoren konstruiert und ihre Anwendung in einem präklinischen Mausmodell für metastasierenden Darmkrebs veranschaulicht. Dieses System ist je nach Krankheitsbiologie in hohem Maße modifizierbar und erzeugt mehrere Krankheitssignale gleichzeitig, was ein umfassendes Verständnis der Krankheitsmerkmale durch einen minimalinvasiven Prozess ermöglicht, der nur die Verabreichung von Nanosensoren, die Urinsammlung und einen Papiertest erfordert, der eine Point-of-Care-Diagnostik ermöglicht.

Einleitung

Trotz der erheblichen Anstrengungen, Tumor-Biomarker wie abgestoßene Proteine und DNA zu identifizieren, wurde das Feld der Krebsdiagnostik durch ihre geringe Häufigkeit oder ihren schnellen Abbau im Kreislauf belastet¹. Als ergänzende Strategie stellen biotechnologisch hergestellte synthetische Biomarker, die selektiv auf Krankheitsmerkmale reagieren, um verstärkte Signale zu erzeugen, neue Wege zu einer genauen und zugänglichen Diagnostik dar ^2,3. Um die Erkennung zu unterstützen, nutzen diese synthetischen Biomarker tumorabhängige Aktivierungsmechanismen wie die enzymatische Amplifik....

Protokoll

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Einrichtung der Autoren genehmigt. Standard-Tierpflegeeinrichtungen wie Haltungskammern, sterile Hauben, Anästhesie und ethische Endpunkt-Euthanasie sind erforderlich, um diese Experimente ordnungsgemäß durchzuführen. Alle Experimente werden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt und vom tierärztlichen Personal der Einrichtung überwacht. Weibliche BALB/c-Mäuse, die für die Experimente verwendet wurden, stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle) und waren zu Beginn der Studie zwischen 6 und 8 Wochen alt....

Diskussion

Hier wird eine hochgradig anpassbare Plattform für die Multiplex-Krebserkennung mit einem tragbaren Urintest vorgestellt, der die krankheitsassoziierte proteolytische Aktivität mit einem minimalinvasiv injizierten Sensor bewertet. Bei Aktivierung durch Tumorproteasen wird die Peptidsubstratspaltung durch DNA-Barcode-Freisetzung in den Urin amplifiziert. Die synthetischen DNA-Reporter in einer Urinprobe können durch eine sekundäre CRISPR-Cas-vermittelte enzymatische Amplifikation mittels fluorometrischer Dete.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225