Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables

Résumé

Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.

Résumé

La création de biomarqueurs synthétiques pour le développement de diagnostics de précision a permis de détecter des maladies par des voies autres que celles utilisées pour les mesures traditionnelles des biofluides. Les biomarqueurs synthétiques utilisent généralement des rapporteurs qui fournissent des signaux lisibles dans le biofluide pour refléter les altérations biochimiques dans le microenvironnement local de la maladie au cours de l’incidence et de la progression de la maladie. La concentration pharmacocinétique des rapporteurs et l’amplification biochimique du signal de la maladie sont primordiales pour obtenir une sensibilité et une spécificité élevées dans un test diagnostique. Ici, une plateforme de diagnostic du cancer est construite à l’aide d’un format de biomarqueurs synthétiques : des nanocapteurs basés sur l’activité transportant des rapporteurs d’ADN chimiquement stabilisés qui peuvent être libérés par des signatures protéolytiques aberrantes dans le microenvironnement tumoral. L’ADN synthétique en tant que rapporteur de maladie offre une capacité de multiplexage grâce à son utilisation comme code-barres, permettant la lecture de plusieurs signatures protéolytiques à la fois. Les rapporteurs d’ADN libérés dans l’urine sont détectés à l’aide de nucléases CRISPR par hybridation avec des ARN CRISPR, qui à leur tour produisent un signal fluorescent ou colorimétrique lors de l’activation de l’enzyme. Dans ce protocole, des nanocapteurs basés sur l’activité sont construits et leur application est illustrée dans un modèle murin préclinique de cancer colorectal métastatique. Ce système est hautement modifiable en fonction de la biologie de la maladie et génère plusieurs signaux de maladie simultanément, permettant une compréhension complète des caractéristiques de la maladie grâce à un processus peu invasif ne nécessitant que l’administration de nanocapteurs, la collecte d’urine et un test papier qui permet des diagnostics sur le lieu d’intervention.

Introduction

Malgré les efforts importants déployés pour identifier les biomarqueurs tumoraux tels que les protéines excrétées et l’ADN, le domaine du diagnostic du cancer a été mis à rude épreuve par leur faible abondance ou leur dégradation rapide dans la circulation¹. En tant que stratégie complémentaire, les biomarqueurs synthétiques issus de la bio-ingénierie qui répondent sélectivement aux caractéristiques de la maladie pour générer des signaux amplifiés représentent de nouvelles voies vers des diagnostics précis et accessibles ^2,3. Pour faciliter la détection, ces biomarqueurs synthétiques ex....

Protocole

Toutes les études sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement des auteurs. Des installations standard de soins aux animaux, y compris des chambres d’hébergement, des cagoules stériles, une anesthésie et une euthanasie éthique, sont nécessaires pour mener à bien ces expériences. Toutes les expériences sont menées conformément aux directives institutionnelles et nationales et supervisées par le personnel vétérinaire de l’établissement. Les souris femelles BALB/c, utilisées pour les expériences, proviennent d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux) et étaient ....

Discussion

Voici une plateforme hautement personnalisable pour la détection multiplexée du cancer avec un test d’urine portable qui évalue l’activité protéolytique associée à la maladie à l’aide d’un capteur injecté mini-invasif. Lorsqu’il est activé par les protéases tumorales, le clivage du substrat peptidique est amplifié par la libération d’un code-barres d’ADN dans l’urine. Les rapporteurs d’ADN synthétique dans un échantillon d’urine peuvent être lus par une amplification enzymatiq.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225