CRISPR-Cas-опосредованный мультианалит синтетический биомаркер мочи для портативной диагностики

Резюме

Этот протокол описывает CRISPR-Cas-опосредованный мультианалитный синтетический биомаркер мочи, который позволяет диагностировать рак в месте оказания медицинской помощи с помощью анализа активности опухоль-ассоциированной протеазы ex vivo.

Аннотация

Создание синтетических биомаркеров для разработки прецизионной диагностики позволило выявлять заболевания с помощью путей, выходящих за рамки тех, которые используются для традиционных измерений биожидкости. Синтетические биомаркеры, как правило, используют репортеры, которые обеспечивают читаемые сигналы в биожидкости, чтобы отразить биохимические изменения в локальном микроокружении болезни во время заболеваемости и прогрессирования заболевания. Фармакокинетическая концентрация репортеров и биохимическая амплификация сигнала заболевания имеют первостепенное значение для достижения высокой чувствительности и специфичности диагностического теста. Здесь платформа для диагностики рака построена с использованием одного из форматов синтетических биомаркеров: основанных на активности наносенсоров, несущих химически стабилизированную ДНК-репортеры, которые могут быть высвобождены аберрантными протеолитическими сигнатурами в микроокружении опухоли. Синтетическая ДНК в качестве источника информации о заболевании обеспечивает возможность мультиплексирования благодаря использованию в качестве штрих-кода, что позволяет считывать несколько протеолитических сигнатур одновременно. ДНК-репортеры, высвобождаемые в мочу, обнаруживаются с помощью нуклеаз CRISPR путем гибридизации с РНК CRISPR, которые, в свою очередь, производят флуоресцентный или колориметрический сигнал при активации фермента. В этом протоколе конструируются наносенсоры со штрих-кодом ДНК, основанные на активности, и их применение иллюстрируется на доклинической мышиной модели метастатического колоректального рака. Эта система легко модифицируется в соответствии с биологией заболевания и генерирует несколько сигналов заболевания одновременно, обеспечивая всестороннее понимание характеристик заболевания с помощью минимально инвазивного процесса, требующего только введения нанодатчиков, сбора мочи и бумажного теста, который позволяет проводить диагностику в месте оказания медицинской помощи.

Введение

Несмотря на значительные усилия по выявлению опухолевых биомаркеров, таких как выделенные белки и ДНК, область диагностики рака была напряжена из-за их низкой распространенности или быстрой деградации в кровообращении^. В качестве дополнительной стратегии биоинженерные синтетические биомаркеры, которые избирательно реагируют на особенности заболевания для генерации усиленных сигналов, представляют собой новые возможности для точной и доступной диагностики ^2,3. Чтобы облегчить обнаружение, эти синтетические биомаркеры используют опухолезависимые механизмы активации, такие как ферментативная амплификация, для получения аналитов с улучшенным отношением сигнал/шум⁴. При этом класс ферментов, связанных с раком, протеаз, используется для активации инъекционных наноразмерных сенсоров для высвобождения сигналов о заболевании, обнаруживаемых из биожидкостей^, таких как кровь или^моча. В свете гетерогенности опухоли разработка панели сенсоров, активируемых протеазой, позволяет проводить мультианалитические тесты, которые объединяют различные события расщепления протеазы в «сигнатуру заболевания» для оценки заболеваемости и прогрессирования рака более специфичным, мультиплексным образом.

Были разработаны синтетические биомаркеры, активируемые протеазой, которые содержат пептидные субстраты, конъюгированные с поверхностью инертного носителя⁷. При введении in vivo эти пептиды переносятся в опухоль, после чего ферментативное расщепление опухолевыми протеазами высвобождает репортеров в кровь или мочу для обнаружения. Мультиплексное обнаружение с помощью синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, требует, чтобы каждый синтетический биомаркер в составе коктейля был помечен уникальным молекулярным штрих-кодом. С этой целью были разработаны различные подходы, в том числе массовые штрих-коды и лиганд-кодированные репортеры ^8,9,10. В отличие от этих методов мультиплексирования, которые могут быть ограничены несколькими различными сигнальными возможностями, штрих-кодирование ДНК позволяет получить гораздо больше комбинаций в соответствии с высокой сложностью и гетерогенностью болезненных состояний человека. Чтобы расширить мультиплексность синтетических биомаркеров, датчики получают штрих-код, помечая каждого репортера уникальной последовательностью ДНК для обнаружения с помощью нуклеазы CRISPR-Cas для усиления биофлюидного сигнала ex vivo. Эти штрих-коды одноцепочечной ДНК (ssDNA) предназначены для связывания с комплементарными направляющими РНК CRISPR (crRNAs), активируя активность коллатеральной нуклеазы CRISPR-Cas12a¹¹. Эта нуклеазная активность может быть использована для расщепления репортерной цепи ДНК, обнаруженной с помощью кинетики флуоресценции или с помощью бумажных полосок.

В дополнение к молекулярной амплификации с помощью протеаз (in vivo) и CRISPR-Cas (ex vivo), еще одной ключевой особенностью конструкции синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, является использование фармакокинетики наноматериалов для увеличения концентрации диагностических сигналов в биожидкостях¹⁰. Одним из подходов является использование носителя наночастиц для увеличения времени циркуляции поверхностно-конъюгированных пептидных субстратов. В качестве наноносителя с относительно небольшим гидродинамическим диаметром и мультивалентностью выбран дендример полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения доставки к опухолям. Несмотря на то, что он достаточно мал, чтобы способствовать доставке опухоли, размер носителя ПЭГ больше, чем граница размера ~5 нм барьера фильтрации клубочков почек, так что только расщепленные пептидные субстраты могут быть очищены в моче, используя преимущества фильтрации по размеру почками¹². В этом протоколе описан многоступенчатый рабочий процесс для синтеза и применения наносенсоров, основанных на активности ДНК со штрих-кодом, в доклинической мышиной модели, подчеркивая настройку CRISPR-Cas-опосредованного, мультианализируемого синтетического биомаркера мочи, который был использован этой группой для классификации статуса заболевания в мышиных моделях нескольких типов рака¹³. Благодаря универсальному принципу конструкции все три функциональных компонента наносенсора - наноноситель (полимер ПЭГ), модуль, реагирующий на стимулы (субстрат, активируемый протеазой) и биофлюидный репортер (штрих-код ДНК) - могут быть точно взаимозаменяемы в соответствии с потребностями конкретного применения, что обеспечивает модульность за счет адаптации к мишени и особенностям выпуска.

протокол

Все исследования на животных одобряются Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в учреждении авторов. Для надлежащего проведения этих экспериментов требуются стандартные помещения по уходу за животными, включая камеры содержания, стерильные капюшоны, анестезию и этичную конечную эвтаназию. Все эксперименты проводятся в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями и под наблюдением ветеринарного персонала учреждения. Самки мышей линии BALB/c, использованные для экспериментов, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов) и имели возраст от 6 до 8 недель в начале исследования. Последовательности для специально синтезированных ДНК, крРНК, пептидных субстратных зондов на основе FRET и сенсорных пептидов представлены в дополнительной таблице 1.

1. Выбор пептидного субстрата, активируемого протеазой

1. Сбор и подготовка образцов тканей из здоровых легких или легочной ткани с опухолевыми узелками в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹³.
   1. Гомогенизируйте ткани в предварительно охлажденном фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) (200 мг ткани/мл PBS) с помощью тканевых диссоциационных трубок для автоматической диссоциации тканей на одноклеточные суспензии.
   2. Центрифуга гомогенирует ткани при 6 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Задержите надосадочную жидкость в новой пробирке.
   3. Центрифугу надосадочной жидкости при 14 000 x g в течение 25 мин при 4 °C.
   4. Измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белков бисинхониновой кислоты (BCA) (см. таблицу материалов).
   5. Добавьте PBS в образец для приготовления раствора 0,33 мг/мл.
2. Оцените протеолитическую активность, выполнив следующие действия.
   1. В 384-луночном планшете добавьте 5 мкл, 6 мкМ пептидных субстратов на основе FRET в каждую лунку. Для каждого зонда выполните реакцию в трех экземплярах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пептидный субстратный зонд на основе FRET содержит короткую пептидную последовательность (6-8 аминокислот, специфичных для целевой протеазы или группы протеаз), оканчивающуюся парой флуорофор и гаситель. В качестве примера в Дополнительной таблице 1 описаны два FRET-зонда. Полную библиотеку зондов можно найти в Hao et al.¹³. См.
   2. Центрифугируйте луночный планшет в течение 10 секунд при комнатной температуре при 180 x g , чтобы убедиться, что зонды находятся на дне планшета.
   3. Добавьте 25 мкл 0,33 мг/мл образца ткани или 40 мкМ рекомбинантной протеазы¹³ в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация образца ткани или рекомбинантной протеазы может быть оптимизирована в соответствии с их собственной протеолитической активностью. Например, высокопротеолитические ткани, такие как кишечник, могут требовать более высоких коэффициентов разбавления, чтобы обеспечить мониторинг начального ферментативного расщепления.
   4. Кратковременно центрифугируйте луночный планшет при 180 x g (при комнатной температуре), чтобы смешать зонды и тканевые лизаты.
   5. Немедленно приступайте к обнаружению расщепления зонда, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 1 ч (λ_ex: 485 нм; λ_em: 535 нм) для контроля спайности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие длины волн возбуждения и излучения для определенных пар флуорофора и гасителя. В данном исследовании для флуорофора FAM задаются параметры (λ_ex: 485 нм и λ_em: 535 нм).
   6. Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python (см. Таблицу материалов) для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V₀), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.

2. Формулировка и определение характеристик датчика

1. Синтезируют конъюгат ДНК и пептида, активируемого протеазой (PAP).
   1. Инкубируют 20-мерные фосфоротиационные репортеры ДНК с 3'-DBCO группой (1,1 экв., см. таблицу материалов) с азид-концевыми ПАП с С-концевым цистеиновым концом в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,0) при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
   2. Очистите продукт с помощью высокоэффективной системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оснащенной колонкой, идеально подходящей для биомолекул (см. Таблицу материалов). Установите градиент ВЭЖХ так, чтобы он начинался с 5% буфера А (0,05% ТЖК в H₂O), выдерживали изократический в течение 20 мин и достигали буфера 80% B (0,05% ТЖК, 99,95% ацетонитрила) через 65 мин с расходом 0,3 мл ^мин-1 и собирали сопряженный продукт со временем удержания при ~31 мин.
   3. Валидация очищенных конъюгатов с помощью масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией во время пролета (MALDI-TOF) с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы¹⁴ (см. таблицу материалов).
2. Синтез ДНК-кодируемых наносенсоров на основе активности.
   1. Растворяют 2 мг поливалентного ПЭГ (40 кДа, 8-плечо, см. таблицу материалов) с малеимидно-реактивной группой в 1 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,0) и фильтра (отсечка: 0,2 мкм).
   2. Добавьте концевые конъюгаты ДНК-пептидов (2 экв., см. таблицу материалов) к ПЭГ и реагируйте при комнатной температуре в течение >4 ч. Если оставить на ночь, инкубируйте при 4 °C.
   3. Удаляют неконъюгированные материалы с помощью эксклюзионной хроматографии с коммерчески доступной композитной матричной колонкой декстрана-агарозы на жидкостной хроматографии быстрого белка (FPLC) (см. таблицу материалов). Запускайте образцы в PBS и контролируйте поглощение на длине волны 260 нм для ДНК и 280 нм для пептида.
   4. Сконцентрировать синтезированные наносенсоры центробежными фильтрующими трубками (MWCO = 10 кДа) в соответствии с рекомендуемой производителем скоростью (см. таблицу материалов).
   5. Количественно определите концентрацию ДНК с помощью набора для анализа ssDNA (см. таблицу материалов) и планшетного ридера при λ_ex: 485 нм и λ_em: 535 нм. Храните наносенсоры при температуре 4 °C.
3. Охарактеризовать ДНК-кодируемые наносенсоры, основанные на активности.
   1. Измерение гидродинамического размера частиц наносенсоров, кодируемых в ДНК, с помощью динамического рассеяния света (DLS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый диапазон размеров наносенсоров составляет 15-50 нм, со средним размером 20-30 нм. Если требуется ограниченный диапазон размеров, FPLC (на этапе 2.3) можно использовать для выделения более узких фракций с различной молекулярной массой.
   2. Концентрируют наносенсоры до 0,5 мг/мл (по концентрации ДНК) с помощью центробежных фильтрующих трубок (MWCO = 10 кДа) и загружают образцы на медную сетку с углеродным покрытием, установленную на криодержателе. Наблюдение морфологии с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии (200 кВ, увеличение 10 000–60 000)¹⁴.

3. Инъекция датчика и сбор мочи

1. Соберите мочу для базового измерения.
   1. Поместите мышь в специальную камеру корпуса (см. дополнительный рисунок 1) с 96-луночной пластиной в качестве основания.
   2. Удерживайте мышь и слегка надавите на мочевой пузырь, чтобы опорожнить оставшуюся мочу на тарелку.
   3. Скопив собранную мочу (~100-200 мкл) из 96-луночного планшета в пробирку объемом 1,5 мл после замены мыши на нормальный корпус.
2. Создание доклинической модели мышиной опухоли.
   1. Инокуляцию 6-8-недельным самкам мышей BALB/c путем внутривенной инъекции клеточной линии MC26-Fluc, экспрессирующей люциферазу (100 тыс. клеток на мышь) (см. таблицу материалов). Еженедельно контролируйте прогрессирование опухоли с помощью системы флуоресцентной визуализации in vivo .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видимая опухолевая нагрузка, на которую указывает люминесцентный сигнал, возникает примерно на 2-й неделе после инъекции этой конкретной клеточной линии. Тщательно осматривайте животных с опухолью во время прогрессирования опухоли на регулярной основе.
3. Вводите наносенсоры в разные моменты времени после имплантации опухоли.
   1. Приготовьте раствор для инъекций (максимальный объем 200 мкл), содержащий наносенсоры в концентрации 1 нмоль по штрих-коду ДНК в стерильном PBS.
   2. Введите 200 мкл раствора сенсора в PBS каждой экспериментальной мыши внутривенно.
4. Соберите образцы мочи у здоровых контрольных мышей и мышей с опухолью через 1 ч после введения датчика, как описано в шагах 1.1-1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие образцы мочи могут быть обработаны для анализа штрих-кода ДНК напрямую или сразу же заморожены на льду.

4. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на основе флуоресценции

1. Используйте свежие образцы мочи или размораживайте замороженные образцы на льду. Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Смешайте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2, добавьте фермент Cas12a (см. таблицу материалов) в последнюю очередь и осторожно перемешайте реакцию путем пипетирования вверх и вниз. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 30 мин.
3. Запустите реакцию репортера, как показано в дополнительной таблице 3, в трех экземплярах, используя произведение шага 2. Добавьте реакцию из шага 2 в последнюю очередь и быстро поднесите к считывающему устройству.
4. Обнаруживайте активацию LbaCas12a, измеряя флуоресценцию с помощью планшетного ридера при 37 °C каждые 2 минуты в течение 3 ч (λ_ex: 485 нм и λ_em: 535 нм) для мониторинга кинетики расщепления ДНК-репортера.
5. Для анализа данных флуоресцентных измерений используйте пакет Python для анализа кинетики ферментов, доступный в https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Этот скрипт вычисляет начальную скорость реакции (V₀), используя наклон линейной аппроксимации первых 8-10 начальных временных точек.

5. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на бумажной основе

1. Центрифужные образцы мочи при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно запускайте образцы мочи для обнаружения CRISPR на основе флуоресценции и на бумаге.
2. Комбинируйте реагенты, указанные в дополнительной таблице 2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап инкубации идентичен этапу обнаружения CRISPR на основе флуоресценции.
3. Запустите репортерную реакцию с использованием ДНК-репортера, меченного FAM-биотином, для анализа бокового потока на бумажной полоске (см. таблицу материалов). Объедините реагенты, указанные в дополнительной таблице 4 , в 96-луночный планшет, используя произведение шага 2. Накрыть алюминиевой фольгой и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите оптимальное время инкубации в соответствии с мониторингом кинетики в режиме реального времени в флуоресцентном анализе обнаружения CRISPR, описанном выше.
4. В свежую лунку 96-луночного планшета добавьте 80 мкл PBS. Добавьте в эту лунку 20 мкл образца с этапа 3.
5. Поместите по одной бумажной полоске бокового потока в каждую лунку и подождите, пока жидкость не достигнет верхней части полоски (<5 минут). Обратите внимание на внешний вид контрольной полосы и/или полосы (полос) для образцов на бумажной полоске.
6. Сфотографируйте полосу бокового потока и количественно оцените интенсивность полосы с помощью ImageJ.

Результаты

Номинирование пептидных субстратов, активируемых протеазой
Для разработки сенсоров, которые будут отражать изменения протеолитической активности ткани, активность протеазы в ткани сначала характеризуют с помощью библиотеки пептидных зондов¹³ (рис....

Обсуждение

Здесь представлена платформа с широкими возможностями настройки для мультиплексного обнаружения рака с портативным анализом мочи, который оценивает протеолитическую активность, связанную с заболеванием, с помощью минимально инвазивного инъекционного датчика. При активации опухоле...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225