Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает CRISPR-Cas-опосредованный мультианалитный синтетический биомаркер мочи, который позволяет диагностировать рак в месте оказания медицинской помощи с помощью анализа активности опухоль-ассоциированной протеазы ex vivo.
Создание синтетических биомаркеров для разработки прецизионной диагностики позволило выявлять заболевания с помощью путей, выходящих за рамки тех, которые используются для традиционных измерений биожидкости. Синтетические биомаркеры, как правило, используют репортеры, которые обеспечивают читаемые сигналы в биожидкости, чтобы отразить биохимические изменения в локальном микроокружении болезни во время заболеваемости и прогрессирования заболевания. Фармакокинетическая концентрация репортеров и биохимическая амплификация сигнала заболевания имеют первостепенное значение для достижения высокой чувствительности и специфичности диагностического теста. Здесь платформа для диагностики рака построена с использованием одного из форматов синтетических биомаркеров: основанных на активности наносенсоров, несущих химически стабилизированную ДНК-репортеры, которые могут быть высвобождены аберрантными протеолитическими сигнатурами в микроокружении опухоли. Синтетическая ДНК в качестве источника информации о заболевании обеспечивает возможность мультиплексирования благодаря использованию в качестве штрих-кода, что позволяет считывать несколько протеолитических сигнатур одновременно. ДНК-репортеры, высвобождаемые в мочу, обнаруживаются с помощью нуклеаз CRISPR путем гибридизации с РНК CRISPR, которые, в свою очередь, производят флуоресцентный или колориметрический сигнал при активации фермента. В этом протоколе конструируются наносенсоры со штрих-кодом ДНК, основанные на активности, и их применение иллюстрируется на доклинической мышиной модели метастатического колоректального рака. Эта система легко модифицируется в соответствии с биологией заболевания и генерирует несколько сигналов заболевания одновременно, обеспечивая всестороннее понимание характеристик заболевания с помощью минимально инвазивного процесса, требующего только введения нанодатчиков, сбора мочи и бумажного теста, который позволяет проводить диагностику в месте оказания медицинской помощи.
Несмотря на значительные усилия по выявлению опухолевых биомаркеров, таких как выделенные белки и ДНК, область диагностики рака была напряжена из-за их низкой распространенности или быстрой деградации в кровообращении. В качестве дополнительной стратегии биоинженерные синтетические биомаркеры, которые избирательно реагируют на особенности заболевания для генерации усиленных сигналов, представляют собой новые возможности для точной и доступной диагностики 2,3. Чтобы облегчить обнаружение, эти синтетические биомаркеры используют опухолезависимые механизмы активации, такие как ферментативная амплификация, для получения аналитов с улучшенным отношением сигнал/шум4. При этом класс ферментов, связанных с раком, протеаз, используется для активации инъекционных наноразмерных сенсоров для высвобождения сигналов о заболевании, обнаруживаемых из биожидкостей, таких как кровь илимоча. В свете гетерогенности опухоли разработка панели сенсоров, активируемых протеазой, позволяет проводить мультианалитические тесты, которые объединяют различные события расщепления протеазы в «сигнатуру заболевания» для оценки заболеваемости и прогрессирования рака более специфичным, мультиплексным образом.
Были разработаны синтетические биомаркеры, активируемые протеазой, которые содержат пептидные субстраты, конъюгированные с поверхностью инертного носителя7. При введении in vivo эти пептиды переносятся в опухоль, после чего ферментативное расщепление опухолевыми протеазами высвобождает репортеров в кровь или мочу для обнаружения. Мультиплексное обнаружение с помощью синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, требует, чтобы каждый синтетический биомаркер в составе коктейля был помечен уникальным молекулярным штрих-кодом. С этой целью были разработаны различные подходы, в том числе массовые штрих-коды и лиганд-кодированные репортеры 8,9,10. В отличие от этих методов мультиплексирования, которые могут быть ограничены несколькими различными сигнальными возможностями, штрих-кодирование ДНК позволяет получить гораздо больше комбинаций в соответствии с высокой сложностью и гетерогенностью болезненных состояний человека. Чтобы расширить мультиплексность синтетических биомаркеров, датчики получают штрих-код, помечая каждого репортера уникальной последовательностью ДНК для обнаружения с помощью нуклеазы CRISPR-Cas для усиления биофлюидного сигнала ex vivo. Эти штрих-коды одноцепочечной ДНК (ssDNA) предназначены для связывания с комплементарными направляющими РНК CRISPR (crRNAs), активируя активность коллатеральной нуклеазы CRISPR-Cas12a11. Эта нуклеазная активность может быть использована для расщепления репортерной цепи ДНК, обнаруженной с помощью кинетики флуоресценции или с помощью бумажных полосок.
В дополнение к молекулярной амплификации с помощью протеаз (in vivo) и CRISPR-Cas (ex vivo), еще одной ключевой особенностью конструкции синтетических биомаркеров, активируемых протеазой, является использование фармакокинетики наноматериалов для увеличения концентрации диагностических сигналов в биожидкостях10. Одним из подходов является использование носителя наночастиц для увеличения времени циркуляции поверхностно-конъюгированных пептидных субстратов. В качестве наноносителя с относительно небольшим гидродинамическим диаметром и мультивалентностью выбран дендример полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения доставки к опухолям. Несмотря на то, что он достаточно мал, чтобы способствовать доставке опухоли, размер носителя ПЭГ больше, чем граница размера ~5 нм барьера фильтрации клубочков почек, так что только расщепленные пептидные субстраты могут быть очищены в моче, используя преимущества фильтрации по размеру почками12. В этом протоколе описан многоступенчатый рабочий процесс для синтеза и применения наносенсоров, основанных на активности ДНК со штрих-кодом, в доклинической мышиной модели, подчеркивая настройку CRISPR-Cas-опосредованного, мультианализируемого синтетического биомаркера мочи, который был использован этой группой для классификации статуса заболевания в мышиных моделях нескольких типов рака13. Благодаря универсальному принципу конструкции все три функциональных компонента наносенсора - наноноситель (полимер ПЭГ), модуль, реагирующий на стимулы (субстрат, активируемый протеазой) и биофлюидный репортер (штрих-код ДНК) - могут быть точно взаимозаменяемы в соответствии с потребностями конкретного применения, что обеспечивает модульность за счет адаптации к мишени и особенностям выпуска.
Все исследования на животных одобряются Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в учреждении авторов. Для надлежащего проведения этих экспериментов требуются стандартные помещения по уходу за животными, включая камеры содержания, стерильные капюшоны, анестезию и этичную конечную эвтаназию. Все эксперименты проводятся в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями и под наблюдением ветеринарного персонала учреждения. Самки мышей линии BALB/c, использованные для экспериментов, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов) и имели возраст от 6 до 8 недель в начале исследования. Последовательности для специально синтезированных ДНК, крРНК, пептидных субстратных зондов на основе FRET и сенсорных пептидов представлены в дополнительной таблице 1.
1. Выбор пептидного субстрата, активируемого протеазой
2. Формулировка и определение характеристик датчика
3. Инъекция датчика и сбор мочи
4. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на основе флуоресценции
5. CRISPR-детектирование штрих-кодов ДНК: на бумажной основе
Номинирование пептидных субстратов, активируемых протеазой
Для разработки сенсоров, которые будут отражать изменения протеолитической активности ткани, активность протеазы в ткани сначала характеризуют с помощью библиотеки пептидных зондов13 (рис....
Здесь представлена платформа с широкими возможностями настройки для мультиплексного обнаружения рака с портативным анализом мочи, который оценивает протеолитическую активность, связанную с заболеванием, с помощью минимально инвазивного инъекционного датчика. При активации опухоле...
S.N.B., L.H. и R.T.Z. указаны в качестве изобретателей в патентной заявке, связанной с содержанием этой работы. S.N.B. владеет долями в Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, а также является директором Vertex; консультирует Moderna и получает спонсируемое финансирование исследований от Johnson & Johnson, Revitope и Owlstone.
Это исследование было частично поддержано грантом Института Коха No P30-CA14051 от Национального института рака (Биотехнологический центр Свенсона), грантом Основного центра P30-ES002109 от Национального института наук об окружающей среде, Мраморным центром наномедицины рака Института Коха, Программой передовых исследований Института Коха через Фонд исследования рака Кэти и Курта Марбл. и Фонд Вирджинии и Д. К. Людвига по исследованию рака. A.E.V.H. поддерживается стипендией для подготовки к докторантуре (T32GM130546), финансируемой NIH. С.Н.Б. является следователем Медицинского института Говарда Хьюза. L.H. поддерживается премией K99/R00 Pathway to Independence Award от Национального института рака и финансированием стартапа от Бостонского университета.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены