Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

Resumo

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Resumo

A criação de biomarcadores sintéticos para o desenvolvimento de diagnósticos de precisão permitiu a detecção de doenças por vias além daquelas usadas para medições tradicionais de biofluidos. Os biomarcadores sintéticos geralmente fazem uso de repórteres que fornecem sinais legíveis no biofluido para refletir as alterações bioquímicas no microambiente local da doença durante a incidência e progressão da doença. A concentração farmacocinética dos repórteres e a amplificação bioquímica do sinal da doença são primordiais para alcançar alta sensibilidade e especificidade em um teste diagnóstico. Aqui, uma plataforma de diagnóstico de câncer é construída usando um formato de biomarcadores sintéticos: nanossensores baseados em atividade carregando repórteres de DNA quimicamente estabilizados que podem ser liberados por assinaturas proteolíticas aberrantes no microambiente tumoral. O DNA sintético como um repórter de doenças oferece capacidade de multiplexação por meio de seu uso como código de barras, permitindo a leitura de várias assinaturas proteolíticas de uma só vez. Os repórteres de DNA liberados na urina são detectados usando nucleases CRISPR via hibridização com RNAs CRISPR, que por sua vez produzem um sinal fluorescente ou colorimétrico após a ativação enzimática. Neste protocolo, nanosensores baseados em atividade e com código de barras de DNA são construídos e sua aplicação é exemplificada em um modelo pré-clínico de câncer colorretal metastático em camundongos. Esse sistema é altamente modificável de acordo com a biologia da doença e gera múltiplos sinais da doença simultaneamente, proporcionando uma compreensão abrangente das características da doença por meio de um processo minimamente invasivo que requer apenas administração de nanosensores, coleta de urina e um teste em papel que permite diagnósticos no ponto de atendimento.

Introdução

Apesar do esforço significativo para identificar biomarcadores tumorais, como proteínas excretadas e DNA, o campo diagnóstico do câncer tem sido tenso por sua baixa abundância ou rápida degradação na circulação¹. Como estratégia complementar, biomarcadores sintéticos bioprojetados que respondem seletivamente às características da doença para gerar sinais amplificados representam novos caminhos para diagnósticos precisos e acessíveis ^2,3. Para auxiliar na detecção, esses biomarcadores sintéticos aproveitam mecanismos de ativação dependentes do tumor, como a amplificação enzimática, para produzir analitos com melhor relação sinal-ruído⁴. Nesse estudo, uma classe de enzimas associadas ao câncer, as proteases, são aproveitadas para ativar sensores injetáveis em nanoescala para liberar repórteres de doenças detectáveis a partir de biofluidos, como sangue ou urina ^5,6. À luz da heterogeneidade tumoral, o desenvolvimento de um painel de sensores ativados por protease permite testes multianalitos que combinam diferentes eventos de clivagem de protease em uma "assinatura da doença" para avaliar a incidência e a progressão do câncer de uma maneira mais específica e multiplexada.

Biomarcadores sintéticos ativados por proteases têm sido desenvolvidos que compreendem substratos peptídicos conjugados à superfície de um transportador inerte⁷. Quando injetados in vivo, esses peptídeos são transportados para o tumor, quando a clivagem enzimática por proteases tumorais libera repórteres no sangue ou na urina para detecção. A detecção multiplexada com biomarcadores sintéticos ativados por protease requer que cada biomarcador sintético dentro de um coquetel seja rotulado com um código de barras molecular exclusivo. Para tanto, várias abordagens têm sido desenvolvidas, incluindo códigos de barras massivos e repórteres codificados por ligantes ^8,9,10. Ao contrário desses métodos de multiplexação, que podem ser limitados a algumas possibilidades diferentes de sinal, o código de barras de DNA oferece muito mais combinações de acordo com a alta complexidade e heterogeneidade dos estados de doença humana. Para expandir a multiplexidade dos biomarcadores sintéticos, os sensores são codificados por código de barras marcando cada repórter com uma sequência de DNA única para detecção via nuclease CRISPR-Cas para amplificar o sinal biofluídico ex vivo. Esses códigos de barras de DNA de fita simples (ssDNA) são projetados para se ligar a RNAs guia CRISPR complementares (crRNAs), ativando a atividade de nuclease colateral desencadeada por alvo de CRISPR-Cas12a¹¹. Essa atividade de nuclease pode ser empregada para clivar uma fita de DNA repórter detectada através de cinética de fluorescência ou usando tiras de papel.

Além da amplificação molecular via proteases (in vivo) e CRISPR-Cas (ex vivo), outra característica chave do projeto de biomarcadores sintéticos ativados por proteases envolve o aproveitamento da farmacocinética de nanomateriais para aumentar a concentração do sinal diagnóstico em biofluidos¹⁰. Uma abordagem é o uso de um carreador de nanopartículas para aumentar o tempo de circulação de substratos peptídicos conjugados à superfície. Um dendrímero de polietilenoglicol (PEG) é selecionado como um nanocarreador com diâmetro hidrodinâmico relativamente pequeno e multivalência para aumentar a entrega aos tumores. Embora pequeno o suficiente para promover a liberação tumoral, o tamanho do carreador de PEG é maior do que o ponto de corte de ~5 nm da barreira de filtração glomerular renal, de modo que apenas substratos peptídicos clivados podem ser limpos na urina, aproveitando a filtração de tamanho pelos rins¹². Neste protocolo, o fluxo de trabalho de múltiplas etapas é delineado para a síntese e aplicação de nanosensores baseados em atividade com código de barras de DNA em um modelo murino pré-clínico, destacando a configuração do teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas, que tem sido empregado por esse grupo para classificar o status da doença em modelos murinos de múltiplos tipos de câncer¹³. Devido ao princípio de design versátil, todos os três componentes funcionais do nanosensor - o nanocarreador (polímero PEG), o módulo responsivo a estímulos (substrato ativado por protease) e o repórter biofluídico (código de barras de DNA) - podem ser trocados com precisão de acordo com as necessidades específicas da aplicação, permitindo a modularidade adaptando as especificidades do alvo e da liberação.

Protocolo

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da instituição dos autores. Instalações padrão de cuidados com animais, incluindo câmaras de alojamento, capuzes estéreis, anestesia e eutanásia ética são necessárias para realizar adequadamente esses experimentos. Todos os experimentos são conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais e supervisionados pela equipe veterinária da instituição. Camundongos BALB/c fêmeas, usados para os experimentos, são obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais) e variaram em idade de 6 a 8 semanas no início do estudo. Sequências para DNA sintetizado sob medida, crRNA, sondas de substrato peptídico baseadas em FRET e peptídeos sensores são fornecidas na Tabela Suplementar 1.

1. Seleção de substratos peptídicos ativados por protease

1. Coletar e preparar amostras de tecido de pulmão normal ou tecido pulmonar com nódulos tumorais após relato publicado^{anteriormente13}.
   1. Homogeneizar tecidos em solução salina tamponada com fosfato pré-refrigerada (PBS, pH 7,4) (200 mg tecido/mL PBS) com tubos de dissociação tecidual para a dissociação automatizada de tecidos em suspensões unicelulares.
   2. O tecido da centrífuga homogeneiza a 6.000 x g por 5 min a 4 °C. Retenha o sobrenadante em um novo tubo.
   3. Centrifugar o sobrenadante a 14.000 x g durante 25 min a 4 °C.
   4. Medir a concentração de proteínas utilizando o kit de ensaio proteico de ácido bicinconínico (BCA) (ver Tabela de Materiais).
   5. Adicionar PBS à amostra para preparar uma solução de 0,33 mg/ml.
2. Avalie a atividade proteolítica seguindo as etapas abaixo.
   1. Em uma placa de 384 poços, adicione sondas de substrato peptídico à base de FRET de 5 μL e 6 μM a cada poço. Para cada sonda, realizar a reação em triplicata.
      NOTA: A sonda de substrato peptídico à base de FRET contém uma sequência peptídica curta (6-8 aminoácidos, projetada para ser específica para uma protease alvo ou grupo de proteases) terminada com um par de fluoróforo e quencher. Duas sondas FRET são descritas na Tabela Suplementar 1 como exemplo. A biblioteca completa de sondas pode ser encontrada em Hao et al.^13º.
   2. Centrifugar a placa do poço por 10 s à temperatura ambiente a 180 x g para garantir que as sondas estejam na parte inferior da placa.
   3. Adicionar 25 μL 0,33 mg/mL de amostra de tecido ou 40 μM de protease^{recombinante 13} a cada poço.
      NOTA: A concentração final da amostra de tecido ou protease recombinante pode precisar ser otimizada de acordo com sua atividade proteolítica intrínseca. Por exemplo, tecidos altamente proteolíticos, como intestinos, podem exigir fatores de diluição mais altos para permitir o monitoramento da clivagem enzimática inicial.
   4. Centrifugar brevemente a placa do poço a 180 x g (à temperatura ambiente) para misturar as sondas e os lisados teciduais.
   5. Comece imediatamente a detectar a clivagem da sonda medindo a fluorescência com o leitor de placas a 37 °C a cada 2 min por 1 h (λ_ex: 485 nm; λ_em: 535 nm) para monitorar a clivagem.
      NOTA: Use os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para pares específicos de fluoróforos e quencher. No caso deste estudo, os parâmetros (λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm) são definidos para o fluoróforo FAM.
   6. Para analisar os dados de medição fluorescente, utilize o pacote Python (consulte Tabela de Materiais) para análise de cinética enzimática disponível em https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula a velocidade de reação inicial (V₀) usando a inclinação do ajuste linear dos primeiros 8-10 pontos de tempo iniciais.

2. Formulação e caracterização do sensor

1. Sintetizar o conjugado de DNA e peptídeo ativado por protease (PAP).
   1. Incubar repórteres de DNA fosforotiotado de 20 mers com grupo 3'-DBCO (1,1 eq., ver Tabela de Materiais) com PAPs terminados com azida com terminação C-terminus cisteína em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) à temperatura ambiente por >4 h. Se sair durante a noite, incubar a 4 °C.
   2. Purificar o produto num sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) equipado com uma coluna ideal para biomoléculas (ver Tabela de Materiais). Ajuste o gradiente de HPLC para iniciar a partir de tampão A a 5% (TFA 0,05% em H₂O), manter isocrático por 20 min e atingir tampão B 80% (TFA 0,05%, acetonitrila 99,95%) em 65 min com fluxo de 0,3 mL ^min-1, e coletar o produto conjugado com tempo de retenção em ~31 min.
   3. Validar os conjugados purificados por espectrometria de massa MALDI-TOF (dessorção/ionização-tempo de voo assistida por matriz) usando ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico como matriz¹⁴ (ver Tabela de Materiais).
2. Sintetizar os nanosensores baseados em atividade codificados por DNA.
   1. Dissolver 2 mg de PEG multivalente (40 kDa, 8 braços, ver Tabela de Materiais) com grupo maleimida-reactivo em 1 ml de tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) e filtro (ponto de corte: 0,2 μm).
   2. Adicione os conjugados DNA-peptídeo terminados com cisteína (2 eq., ver Tabela de Materiais) ao PEG e reaja à temperatura ambiente por >4 h. Se sair durante a noite, incubar a 4 °C.
   3. Remova os materiais não conjugados usando cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna de matriz composta de dextran-agarose comercialmente disponível em uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) (ver Tabela de Materiais). Executar amostras em PBS e monitorar a absorbância a 260 nm para DNA e 280 nm para peptídeo.
   4. Concentrar os nanosensores sintetizados com tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) de acordo com a velocidade recomendada pelo fabricante (ver Tabela de Materiais).
   5. Quantificar a concentração de ADN utilizando o kit de ensaio ssDNA (ver Tabela de Materiais) e um leitor de placas em λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm. Conservar os nanosensores a 4 °C.
3. Caracterizar os nanosensores baseados em atividade codificados por DNA.
   1. Medir o tamanho hidrodinâmico de partículas de nanosensores codificados por DNA por espalhamento dinâmico de luz (DLS).
      NOTA: A faixa de tamanho esperada dos nanosensores é de 15-50 nm, com um tamanho médio de 20-30 nm. Se uma faixa de tamanho limitada for desejada, a FPLC (na etapa 2.3) pode ser usada para isolar frações mais estreitas com pesos moleculares diferentes.
   2. Concentrar os nanosensores a 0,5 mg/mL (por concentração de DNA) com tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) e carregar as amostras em uma grade de cobre revestida por filme de carbono montada em um criosuporte. Observar a morfologia por microscopia eletrônica de transmissão criogênica (200 kV, aumento de 10.000-60.000)¹⁴.

3. Injeção do sensor e coleta de urina

1. Coletar urina para medição basal.
   1. Coloque o mouse em uma câmara de alojamento personalizada (consulte a Figura Suplementar 1) com uma placa de 96 poços como base.
   2. Restrinja o rato e aplique uma pressão suave na bexiga para urinar qualquer urina restante na placa.
   3. Pipetar a urina coletada (~100-200 μL) da placa de 96 poços para um tubo de 1,5 mL após substituir o mouse para o alojamento normal.
2. Estabelecer modelo pré-clínico de tumor murino.
   1. Inocular camundongos fêmeas BALB/c de 6 a 8 semanas de idade por injeção intravenosa com linhagem celular MC26-Fluc que expressa luciferase (100k células/camundongo) (ver Tabela de Materiais). Monitorar a progressão tumoral semanalmente usando um sistema de imagem de fluorescência in vivo .
      NOTA: A carga tumoral visível indicada pelo sinal luminescente ocorre aproximadamente na semana 2 de injeção desta linhagem celular em particular. Verifique cuidadosamente os animais portadores de tumor durante a progressão do tumor regularmente.
3. Injetar nanosensores em diferentes momentos após a implantação do tumor.
   1. Preparar uma solução de injeção (volume máximo de 200 μL) contendo nanosensores a uma concentração de 1 nmol por código de barras de DNA em PBS estéril.
   2. Injetar 200 μL de solução sensorial em PBS em cada camundongo experimental por via intravenosa.
4. Coletar amostras de urina de camundongos controles saudáveis e portadores de tumor em 1 h após a injeção do sensor, conforme descrito nas etapas 1.1-1.3.
   NOTA: Amostras de urina fresca podem ser processadas para análise de código de barras de DNA diretamente ou congeladas imediatamente no gelo.

4. Detecção CRISPR de códigos de barras de DNA: baseado em fluorescência

1. Use amostras de urina fresca ou descongele amostras congeladas no gelo. Centrifugar amostras de urina a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
2. Combinar os reagentes do Quadro Suplementar 2, adicionar a enzima Cas12a (ver Tabela de Materiais) por último e misturar suavemente a reacção pipetando para cima e para baixo. Incubar a reação a 37 °C por 30 min.
3. Execute a reação do repórter, como mostrado na Tabela Suplementar 3, em triplicata usando o produto da etapa 2. Adicione a reação do Passo 2 por último e leve rapidamente ao leitor de placas.
4. Detectar a ativação de LbaCas12a medindo fluorescência com um leitor de placas a 37 °C a cada 2 min por 3 h (λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm) para monitorar a cinética de clivagem do repórter de DNA.
5. Para analisar os dados de medição fluorescente, utilize o pacote Python para análise de cinética enzimática disponível em https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula a velocidade de reação inicial (V₀) usando a inclinação do ajuste linear dos primeiros 8-10 pontos de tempo iniciais.

5. Detecção CRISPR de códigos de barras de DNA: baseado em papel

1. Centrifugar amostras de urina a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Execute as amostras de urina para detecção CRISPR baseada em fluorescência e em papel em paralelo.
2. Combinar os reagentes na Tabela Suplementar 2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Esta etapa de incubação é idêntica à da detecção CRISPR baseada em fluorescência.
3. Execute a reação do repórter usando o repórter de DNA marcado com biotina FAM para o ensaio de fluxo lateral em uma tira de papel (consulte a Tabela de Materiais). Combinar os reagentes da Tabela Suplementar 4 em uma placa de 96 poços usando o produto da etapa 2. Cubra com papel alumínio e incube a 37 °C por 1 h.
   NOTA: Selecione o tempo de incubação ideal de acordo com o monitoramento cinético em tempo real no ensaio de detecção CRISPR baseado em fluorescência descrito acima.
4. Para um poço fresco de uma placa de 96 poços, adicione 80 μL de PBS. Adicionar 20 μL de amostra do passo 3 a este poço.
5. Coloque uma tira de papel de fluxo lateral em cada poço e aguarde até que o líquido atinja o topo da tira (<5 min). Procure a aparência da(s) faixa(s) de controle e/ou amostra(s) na tira de papel.
6. Tire uma foto da faixa de fluxo lateral e quantifique a intensidade da banda usando o ImageJ.

Resultados

Nomeação de substratos peptídicos ativados por protease
Para projetar sensores que reflitam mudanças na atividade proteolítica do tecido, primeiramente caracteriza-se a atividade de proteases no tecido por meio de uma biblioteca de sondas peptídicas¹³ (Figura 1). Amostras de tecido fresco e congelado podem fornecer informações substanciais sobre a atividade proteolítica do microambiente tumoral combinando amostras de tecido com sondas FRET...

Discussão

Apresentamos aqui uma plataforma altamente personalizável para detecção de câncer multiplexado com um teste de urina portátil que avalia a atividade proteolítica associada à doença usando um sensor injetado minimamente invasivo. Quando ativada por proteases tumorais, a clivagem do substrato peptídico é amplificada via liberação de código de barras de DNA na urina. Os repórteres de DNA sintético em uma amostra de urina podem ser lidos por uma amplificação enzimática secundária mediada por CRISP...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225