携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

要約

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex vivo分析を通じてポイントオブケアがん診断を可能にします。

要約

精密診断の開発のための合成バイオマーカーの作成により、従来の生体液測定に使用される経路を超えた経路で疾患を検出できるようになりました。合成バイオマーカーは、一般に、疾患の発生率および進行中の局所疾患微小環境における生化学的変化を反映するために、生体液中に読み取り可能なシグナルを提供するレポーターを利用します。レポーターの薬物動態濃度と疾患シグナルの生化学的増幅は、診断検査で高い感度と特異性を達成するために最も重要です。ここでは、がん診断プラットフォームが、合成バイオマーカーの1つのフォーマット、つまり、腫瘍微小環境における異常なタンパク質分解シグネチャーによって解放される化学的に安定化されたDNAレポーターを運ぶ活性ベースのナノセンサーを使用して構築されています。疾患レポーターとしての合成DNAは、バーコードとして使用することでマルチプレックス化が可能で、複数のタンパク質分解シグネチャーを一度に読み取ることができます。尿中に放出されたDNAレポーターは、CRISPR RNAとのハイブリダイゼーションを介してCRISPRヌクレアーゼを使用して検出され、酵素の活性化時に蛍光または比色シグナルを生成します。このプロトコルでは、DNAバーコード化された活動ベースのナノセンサーが構築され、その応用は転移性結腸直腸癌の前臨床マウスモデルで例証されます。このシステムは、疾患の生物学的特性に応じて高度に修正可能であり、複数の疾患シグナルを同時に生成するため、ナノセンサーの投与、採尿、およびポイントオブケア診断を可能にする紙の検査のみを必要とする低侵襲プロセスを通じて、疾患特性を包括的に理解することができます。

概要

脱落したタンパク質やDNAなどの腫瘍バイオマーカーを特定するための多大な努力にもかかわらず、がん診断分野は、それらの存在量が少ないか、循環中で急速に分解されるため、逼迫^{してきました1。}補完的な戦略として、疾患の特徴に選択的に応答して増幅されたシグナルを生成するバイオエンジニアリング合成バイオマーカーは、正確でアクセスしやすい診断への新しい道を示しています^2,3。検出を支援するために、これらの合成バイオマーカーは、酵素増幅などの腫瘍依存的な活性化メカニズムを利用して、S/^{N比が向上し}た分析種を生成します4。本明細書では、癌関連酵素の一種であるプロテアーゼを利用して、注射可能なナノスケールセンサーを活性化し、血液や尿などの体液から検出可能な疾患レポーターを放出します^5,6。腫瘍の不均一性に照らして、プロテアーゼ活性化センサーのパネルを開発することで、さまざまなプロテアーゼ切断イベントを「疾患シグネチャー」に組み合わせて、より特異的で多重化された方法でがんの発生率と進行を評価する多検体検査が可能になります。

プロテアーゼ活性化合成バイオマーカーは、不^活性担体の表面に結合したペプチド基質を含む7。in vivoで注射すると、これらのペプチドは腫瘍に運ばれ、腫瘍プロテアーゼによる酵素切断により、レポーターが血液または尿中に放出され、検出されます。プロテアーゼ活性化合成バイオマーカーによるマルチプレックス検出では、カクテル内の各合成バイオマーカーに固有の分子バーコードで標識する必要があります。この目的のために、マスバーコードやリガンドコード^{レポーター8,9,10}など、さまざまなアプローチが開発されてきました。これらのマルチプレックス法は、少数の異なるシグナルの可能性に限定される可能性があり、DNAバーコーディングは、ヒトの疾患状態の高い複雑さと不均一性に応じて、より多くの組み合わせを提供します。合成バイオマーカーのマルチプレックス性を高めるため、センサーは、CRISPR-Casヌクレアーゼを介して検出するための固有のDNA配列で各レポーターを標識し、生体外で生体流体シグナルを増幅することでバーコード化されます。これらの一本鎖DNA(ssDNA)バーコードは、相補的なCRISPRガイドRNA(crRNA)に結合し、CRISPR-Cas12aの標的トリガーコラテラルヌクレアーゼ活性を活性化するように設計されています¹¹。このヌクレアーゼ活性を利用して、蛍光速度論または紙片を用いて検出したレポーターDNA鎖を切断することができます。

プロテアーゼ(in vivo)およびCRISPR-Cas(ex vivo)による分子増幅に加えて、プロテアーゼ活性化合成バイオマーカーのもう1つの重要な設計上の特徴は、ナノ材料の薬物動態を利用して生体液中の診断シグナル濃度を高めることです¹⁰。1つのアプローチは、表面結合ペプチド基質の循環時間を長くするためのナノ粒子担体の使用です。ポリエチレングリコール(PEG)デンドリマーは、比較的小さな流体力学的直径と多価性を持つナノキャリアとして選択され、腫瘍への送達を増加させます。PEGキャリアのサイズは、腫瘍送達を促進するのに十分な大きさであるが、腎臓糸球体濾過バリアの~5 nmサイズのカットオフよりも大きいため、腎臓によるサイズ濾過を利用して、切断されたペプチド基質のみが尿中に除去される可能性がある¹²。このプロトコルでは、前臨床マウスモデルにおけるDNAバーコード付き活性ベースのナノセンサーの合成と応用のための多段階のワークフローが概説されており、CRISPR-Casを介した多分析物合成尿バイオマーカー検査のセットアップを強調しています 複数の癌タイプのマウスモデルの疾患状態を分類するためにこのグループによって採用されています¹³.汎用性の高い設計原理により、ナノセンサーの3つの機能コンポーネント(ナノキャリア(PEGポリマー)、刺激応答性モジュール(プロテアーゼ活性化基質)、生体流体レポーター(DNAバーコード))すべてをアプリケーション固有のニーズに応じて正確に交換でき、ターゲットと放出の特異性を調整することでモジュール化が可能になります。

プロトコル

すべての動物実験は、著者の施設の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。これらの実験を適切に実施するには、飼育室、滅菌フード、麻酔、倫理的エンドポイントの安楽死などの標準的な動物飼育施設が必要です。すべての実験は、施設および国のガイドラインに準拠して実施され、施設の獣医師スタッフによって監督されます。実験に使用した雌のBALB/cマウスは、市販の供給源( 資料表を参照)から入手し、研究開始時の年齢は6〜8週間でした。カスタム合成DNA、crRNA、FRETベースのペプチド基質プローブ、およびセンサーペプチドの配列を 補足表1に示します。

1. プロテアーゼ活性化ペプチド基質の選択

1. 以前に公開されたレポート¹³に従って、健康な肺または腫瘍結節のある肺組織から組織サンプルを収集して準備します。
   1. 組織を単細胞懸濁液に自動解離するために、組織解離チューブを使用して、事前に冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)(200 mg 組織/mL PBS)で組織をホモジナイズします。
   2. 遠心分離機は、6,000 x g で4°Cで5分間組織をホモジネートします。 上清を新しいチューブに保持します。
   3. 上清を14,000 x g で4°Cで25分間遠心分離します。
   4. ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を使用してタンパク質濃度を測定します。
   5. サンプルにPBSを添加し、0.33 mg/mL溶液を調製します。
2. 以下の手順に従ってタンパク質分解活性を評価します。
   1. 384ウェルプレートで、5 μL、6 μMのFRETベースのペプチド基質プローブを各ウェルに加えます。各プローブについて、3回に分けて反応を行います。
      注:FRETベースのペプチド基質プローブには、蛍光色素とクエンチャーのペアで終端された短いペプチド配列(ターゲットプロテアーゼまたはプロテアーゼのグループに特異的に設計された6〜8アミノ酸)が含まれています。2つのFRETプローブを例として補足 表1 に記載する。プローブの完全なライブラリは、Hao et al. にあります。¹³.
   2. ウェルプレートを室温で180 x g で10秒間遠心分離し、プローブがプレートの底にあることを確認します。
   3. 25 μL、0.33 mg/mLの組織サンプルまたは40 μMの組換えプロテアーゼ¹³ を各ウェルに加えます。
      注:組織サンプルまたは組換えプロテアーゼの最終濃度は、それらの固有のタンパク質分解活性に応じて最適化する必要がある場合があります。例えば、腸などのタンパク質分解性の高い組織では、初期の酵素切断のモニタリングを可能にするために、より高い希釈係数が必要になる場合があります。
   4. ウェルプレートを180 x g (室温)で短時間遠心分離し、プローブと組織溶解物を混合します。
   5. プレートリーダーで37°Cの蛍光を2分ごとに1時間測定し(λ_例:485 nm、_λem:535 nm)、切断をモニターすることにより、プローブ切断の検出を直ちに開始します。
      注:特定の蛍光色素とクエンチャーのペアには、適切な励起波長と発光波長を使用してください。この試験では、FAM蛍光色素のパラメータ(λ_ex: 485 nmおよびλ_em: 535 nm)を設定しています。
   6. 蛍光測定データを解析するには、Python( 材料表を参照)パッケージを利用して、https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic で入手可能な酵素動態解析を行います。このスクリプトは、最初の 8 から 10 個の初期時点の線形近似の傾きを使用して、初期反応速度 (V₀) を計算します。

2. センサの定式化と特性評価

1. DNAとプロテアーゼ活性化ペプチド(PAP)のコンジュゲートを合成します。
   1. 20 mer のホスホロチオエート化 DNA レポーターを 3'-DBCO 基(1.1 式、 材料表を参照)とアジド末端 PAP と C 末端システイン末端の 100 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温で >4 時間インキュベートします。一晩放置する場合は、4°Cでインキュベートします。
   2. 生体分子に最適なカラムを備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムで製品を精製します( 材料表を参照)。HPLC グラジエントを 5% A バッファー(0.05% TFA in H₂O)から開始し、アイソクラティックを 20 分間保持し、流速 0.3 mL ^min-1 で 65 分間で 80% B バッファー(0.05% TFA、99.95% アセトニトリル)に達するように設定し、保持時間 ~31 分でコンジュゲート生成物を回収します。
   3. α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸をマトリックス¹⁴として使用し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間(MALDI-TOF)質量分析により、精製されたコンジュゲートを検証します( 材料表を参照)。
2. DNAにコードされた活性ベースのナノセンサーを合成します。
   1. マレイミド反応性基を含む多価PEG(40 kDa、8アーム、 材料表を参照)2 mgを1 mLの100 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)およびフィルター(カットオフ:0.2 μm)に溶解します。
   2. システイン末端DNA-ペプチド複合体(2式、 材料表を参照)をPEGに添加し、室温で>4時間反応させます。一晩放置する場合は、4°Cでインキュベートします。
   3. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)で市販のデキストラン-アガロース複合マトリックスカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、非標識物質を除去します( 材料表を参照)。PBSでサンプルを分析、DNAの場合は260 nm、ペプチドの場合は280 nmの吸光度をモニターします。
   4. 合成したナノセンサーを遠心フィルターチューブ(MWCO = 10 kDa)でメーカーの推奨速度に従って濃縮します( 材料表を参照)。
   5. ssDNAアッセイキット( 材料表を参照)とプレートリーダー(λ_ex:485 nmおよびλ_em:535 nm)を使用して、DNAの濃度を定量します。ナノセンサーは4°Cで保管してください。
3. DNAにコードされた活性ベースのナノセンサーの特性評価
   1. 動的光散乱(DLS)により、DNAにコードされたナノセンサーの流体力学的粒子径を測定します。
      注:ナノセンサーの予想されるサイズ範囲は15〜50nmで、平均サイズは20〜30nmです。限られたサイズ範囲が必要な場合は、FPLC(ステップ2.3)を使用して、分子量の異なるより狭いフラクションを単離できます。
   2. 遠心フィルターチューブ(MWCO = 10 kDa)でナノセンサーを0.5 mg/mL(DNA濃度)に濃縮し、クライオホルダーに取り付けられた炭素膜コーティングされた銅グリッドにサンプルをロードします。極低温透過型電子顕微鏡(200 kV、倍率10,000-60,000)¹⁴を使用して形態を観察します。

3.センサー注入と採尿

1. ベースライン測定のために尿を収集します。
   1. マウスを、96ウェルプレートをベースにしたカスタムハウジングチャンバー( 補足図1を参照)に入れます。
   2. マウスを拘束し、膀胱に穏やかな圧力をかけて、プレートに残っている尿を排します。.
   3. マウスを通常のハウジングに交換した後、96ウェルプレートから採取した尿(~100-200 μL)を1.5 mLチューブにピペットで移します。
2. 前臨床マウス腫瘍モデルを確立する。
   1. 6〜8週齢のBALB/c雌マウスに、ルシフェラーゼ発現MC26-Fluc細胞株(100k細胞/マウス)を静脈内注射で接種します( 資料表参照)。 in vivo 蛍光イメージングシステムを使用して、腫瘍の進行を毎週監視します。
      注:発光シグナルによって示される目に見える腫瘍量は、この特定の細胞株の注射の約2週目に発生します。腫瘍の進行中に腫瘍を持つ動物を定期的に注意深くチェックしてください。
3. 腫瘍移植後のさまざまな時点でナノセンサーを注入します。
   1. 滅菌PBS中のDNAバーコードにより、1nmolの濃度のナノセンサーを含む注入溶液(最大容量200μL)を調製します。
   2. PBSに200 μLのセンサー溶液を各実験マウスに静脈内注射します。
4. ステップ1.1〜1.3の説明に従って、センサー注入の1時間後に健康な対照マウスおよび腫瘍担持マウスから尿サンプルを採取します。
   注:新鮮な尿サンプルは、DNAバーコード分析に直接処理することも、氷上ですぐに凍結することもできます。

4. DNAバーコードのCRISPR検出:蛍光ベース

1. 新鮮な尿サンプルを使用するか、凍結したサンプルを氷上で解凍します。尿サンプルを室温で800 x g で5分間遠心分離します。
2. 付表2の試薬を合わせ、最後にCas12a酵素(材料表参照)を添加し、ピペッティングで上下させて反応液を静かに混合します。反応液を37°Cで30分間インキュベートします。
3. 補足表3に示すように、ステップ2の生成物を用いてレポーター反応を3回に分けて実行する。ステップ2の反応を最後に追加し、プレートリーダーにすばやく持っていきます。
4. プレートリーダーで37°Cの蛍光を2分ごとに3時間測定し(λ_例:485 nm、λ_例:535 nm)、DNAレポーターの切断速度をモニターすることにより、LbaCas12aの活性化を検出します。
5. 蛍光測定データを解析するには、https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic で入手可能な酵素動態解析用のPythonパッケージを利用します。このスクリプトは、最初の 8 から 10 個の初期時点の線形近似の傾きを使用して、初期反応速度 (V₀) を計算します。

5. DNAバーコードのCRISPR検出:紙ベース

1. 尿サンプルを室温で800 x g で5分間遠心分離します。
   注:蛍光ベースのCRISPR検出と紙ベースのCRISPR検出のために、尿サンプルを並行して分析します。
2. 付表2の試薬を併用する。37°Cで30分間インキュベートします。
   注:このインキュベーションステップは、蛍光ベースのCRISPR検出のインキュベーションステップと同じです。
3. 紙片上でラテラルフローアッセイ用のFAM-ビオチン標識DNAレポーターを使用してレポーター反応を実行します( 材料表を参照)。補足 表4 の試薬をステップ2の生成物を用いて96ウェルプレートに混合する。アルミホイルで覆い、37°Cで1時間インキュベートします。
   注:上記の蛍光ベースのCRISPR検出アッセイにおけるリアルタイム動態モニタリングに従って、最適なインキュベーション時間を選択してください。
4. 96ウェルプレートのフレッシュウェルに、80 μLのPBSを添加します。ステップ3のサンプル20 μLをこのウェルに加えます。
5. 各ウェルにラテラルフローペーパーストリップを1枚ずつ置き、液体がストリップの上部に到達するまで待ちます(<5分)。用紙ストリップ上のコントロールバンドやサンプルバンドの外観を確認します。
6. ラテラルフローストリップの画像を撮影し、ImageJ を使用してバンド強度を定量化します。

結果

プロテアーゼ活性化ペプチド基質の指名
組織のタンパク質分解活性の変化を反映するセンサーを設計するために、まずペプチドプローブ¹³ のライブラリを使用して組織内のプロテアーゼ活性を特徴付けます(図1)。新鮮および凍結組織サンプルは、組織サンプルと基質切断を検出するように設計されたFRETプローブを組み合わせることによ...

ディスカッション

ここでは、低侵襲注射センサーを使用して疾患に関連するタンパク質分解活性を評価するポータブル尿検査を備えたマルチプレックスがん検出のための高度にカスタマイズ可能なプラットフォームを紹介します。腫瘍プロテアーゼによって活性化されると、ペプチド基質の切断は、DNAバーコードが尿中に放出 されることによって 増幅されます。尿サンプル中の合成DNAレポーターは、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225