携帯型診断のためのCRISPR-Cas媒介多検体合成尿バイオマーカー検査

要約

このプロトコルでは、CRISPR-Casを介した多検体合成尿バイオマーカー検査について説明しており、腫瘍関連プロテアーゼ活性のex vivo分析を通じてポイントオブケアがん診断を可能にします。

要約

精密診断の開発のための合成バイオマーカーの作成により、従来の生体液測定に使用される経路を超えた経路で疾患を検出できるようになりました。合成バイオマーカーは、一般に、疾患の発生率および進行中の局所疾患微小環境における生化学的変化を反映するために、生体液中に読み取り可能なシグナルを提供するレポーターを利用します。レポーターの薬物動態濃度と疾患シグナルの生化学的増幅は、診断検査で高い感度と特異性を達成するために最も重要です。ここでは、がん診断プラットフォームが、合成バイオマーカーの1つのフォーマット、つまり、腫瘍微小環境における異常なタンパク質分解シグネチャーによって解放される化学的に安定化されたDNAレポーターを運ぶ活性ベースのナノセンサーを使用して構築されています。疾患レポーターとしての合成DNAは、バーコードとして使用することでマルチプレックス化が可能で、複数のタンパク質分解シグネチャーを一度に読み取ることができます。尿中に放出されたDNAレポーターは、CRISPR RNAとのハイブリダイゼーションを介してCRISPRヌクレアーゼを使用して検出され、酵素の活性化時に蛍光または比色シグナルを生成します。このプロトコルでは、DNAバーコード化された活動ベースのナノセンサーが構築され、その応用は転移性結腸直腸癌の前臨床マウスモデルで例証されます。このシステムは、疾患の生物学的特性に応じて高度に修正可能であり、複数の疾患シグナルを同時に生成するため、ナノセンサーの投与、採尿、およびポイントオブケア診断を可能にする紙の検査のみを必要とする低侵襲プロセスを通じて、疾患特性を包括的に理解することができます。

概要

脱落したタンパク質やDNAなどの腫瘍バイオマーカーを特定するための多大な努力にもかかわらず、がん診断分野は、それらの存在量が少ないか、循環中で急速に分解されるため、逼迫^{してきました1。}補完的な戦略として、疾患の特徴に選択的に応答して増幅されたシグナルを生成するバイオエンジニアリング合成バイオマーカーは、正確でアクセスしやすい診断への新しい道を示しています^2,3。検出を支援するために、これらの合成バイオマーカーは、酵素増幅などの腫瘍依存的な活性化メカニズムを利用して、S/^{N比が向上し}た分析種を生成します4。本明細書では、癌関連酵素の一種であるプロテアーゼを利用して、注射可能なナノスケールセンサーを活性化し、血液や尿などの体液から検出可能な疾患レポーターを放出します^5,6。腫瘍の不均一性に照らして、プロテアーゼ活性化センサーのパネルを開発することで、さまざまなプロテアーゼ切断イベントを「疾患シグネチャー」に組み合わせて、より特異的で多重化された方法でがんの発生率と進行を評価する多検体検査が可能になります。

プロテアーゼ活性化合成バイオマーカーは、不

プロトコル

すべての動物実験は、著者の施設の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。これらの実験を適切に実施するには、飼育室、滅菌フード、麻酔、倫理的エンドポイントの安楽死などの標準的な動物飼育施設が必要です。すべての実験は、施設および国のガイドラインに準拠して実施され、施設の獣医師スタッフによって監督されます。実験に使用した雌のBALB/cマウスは、市販の供給源( 資料表を参照)から入手し、研究開始時の年齢は6〜8週間でした。カスタム合成DNA、crRNA、FRETベースのペプチド基質プローブ、およびセンサーペプチドの配列を 補足表1に示します。

1. プロテアーゼ活性化ペプチド基質の選択

1. 以前に公開されたレポート¹³に従って、健康な肺または腫瘍結節のある肺組織から組織サンプルを収集して準備します。
   1. 組織を単細胞懸濁液に自動解離するために、組織解離チューブを使用して、事前に冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)(200 mg 組織/mL PBS)で組織をホモジナイズします。
   2. 遠心分離機は、6,000 x g で4°Cで5分間組織をホモジネートします。 上清を新しいチューブに保持します。
   3. 上清を14,000 ....

ディスカッション

ここでは、低侵襲注射センサーを使用して疾患に関連するタンパク質分解活性を評価するポータブル尿検査を備えたマルチプレックスがん検出のための高度にカスタマイズ可能なプラットフォームを紹介します。腫瘍プロテアーゼによって活性化されると、ペプチド基質の切断は、DNAバーコードが尿中に放出 されることによって 増幅されます。尿サンプル中の合成DNAレポーターは、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225