Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile

Riepilogo

Questo protocollo descrive un test di biomarcatori urinari sintetici multianalita mediato da CRISPR-Cas che consente la diagnostica del cancro point-of-care attraverso l'analisi ex vivo delle attività della proteasi associata al tumore.

Abstract

La creazione di biomarcatori sintetici per lo sviluppo di strumenti diagnostici di precisione ha consentito di rilevare le malattie attraverso percorsi diversi da quelli utilizzati per le tradizionali misurazioni dei biofluidi. I biomarcatori sintetici generalmente fanno uso di reporter che forniscono segnali leggibili nel biofluido per riflettere le alterazioni biochimiche nel microambiente locale della malattia durante l'incidenza e la progressione della malattia. La concentrazione farmacocinetica dei reporter e l'amplificazione biochimica del segnale della malattia sono fondamentali per ottenere un'elevata sensibilità e specificità in un test diagnostico. Qui, una piattaforma diagnostica del cancro è costruita utilizzando un formato di biomarcatori sintetici: nanosensori basati sull'attività che trasportano reporter di DNA stabilizzati chimicamente che possono essere liberati da firme proteolitiche aberranti nel microambiente tumorale. Il DNA sintetico come reporter di malattie offre capacità di multiplexing attraverso il suo uso come codice a barre, consentendo la lettura di più firme proteolitiche contemporaneamente. I reporter di DNA rilasciati nelle urine vengono rilevati utilizzando le nucleasi CRISPR tramite ibridazione con RNA CRISPR, che a loro volta producono un segnale fluorescente o colorimetrico al momento dell'attivazione enzimatica. In questo protocollo, vengono costruiti nanosensori basati sull'attività con codice a barre del DNA e la loro applicazione è esemplificata in un modello murino preclinico di cancro colorettale metastatico. Questo sistema è altamente modificabile in base alla biologia della malattia e genera più segnali di malattia contemporaneamente, consentendo una comprensione completa delle caratteristiche della malattia attraverso un processo minimamente invasivo che richiede solo la somministrazione di nanosensori, la raccolta delle urine e un test cartaceo che consente la diagnostica point-of-care.

Introduzione

Nonostante lo sforzo significativo per identificare i biomarcatori tumorali come le proteine e il DNA, il campo diagnostico del cancro è stato messo a dura prova dalla loro bassa abbondanza o dalla rapida degradazione in^{circolazione.} Come strategia complementare, i biomarcatori sintetici bioingegnerizzati che rispondono selettivamente alle caratteristiche della malattia per generare segnali amplificati rappresentano nuove strade verso una diagnostica accurata e accessibile ^2,3. Per facilitare il rilevamento, questi biomarcatori sintetici sfruttano i meccanismi di attivazione dipendenti dal tumore, come l'amplificazione enzimatica, per produrre analiti con un migliore rapporto segnale/rumore⁴. In questo caso, una classe di enzimi associati al cancro, le proteasi, viene sfruttata per attivare sensori iniettabili su scala nanometrica per rilasciare reporter di malattia rilevabili dai biofluidi come sangue o urina ^5,6. Alla luce dell'eterogeneità del tumore, lo sviluppo di un pannello di sensori attivati dalla proteasi consente di eseguire test multianalita che combinano diversi eventi di scissione della proteasi in una "firma della malattia" per valutare l'incidenza e la progressione del cancro in modo più specifico e multiplexato.

Sono stati sviluppati biomarcatori sintetici attivati dalla proteasi che comprendono substrati peptidici coniugati alla superficie di un carrier inerte⁷. Quando iniettati in vivo, questi peptidi vengono trasportati al tumore, dopodiché la scissione enzimatica da parte delle proteasi tumorali rilascia reporter nel sangue o nelle urine per il rilevamento. Il rilevamento multiplexato con biomarcatori sintetici attivati dalla proteasi richiede che ogni biomarcatore sintetico all'interno di un cocktail sia etichettato con un codice a barre molecolare univoco. A tal fine, sono stati sviluppati vari approcci, tra cui i codici a barre di massa e i reporter codificati con ligando ^8,9,10. A differenza di questi metodi di multiplexing, che possono essere limitati a poche diverse possibilità di segnale, il DNA barcoding offre molte più combinazioni in conformità con l'elevata complessità ed eterogeneità degli stati patologici umani. Per espandere la multiplexità dei biomarcatori sintetici, i sensori sono codificati a barre etichettando ogni reporter con una sequenza di DNA univoca per il rilevamento tramite nucleasi CRISPR-Cas per amplificare il segnale biofluidico ex vivo. Questi codici a barre di DNA a singolo filamento (ssDNA) sono progettati per legarsi agli RNA guida CRISPR complementari (crRNA), attivando l'attività nucleasica collaterale innescata dal bersaglio di CRISPR-Cas12a¹¹. Questa attività nucleasica può essere impiegata per scindere un filamento di DNA reporter rilevato attraverso la cinetica di fluorescenza o utilizzando strisce di carta.

Oltre all'amplificazione molecolare tramite proteasi (in vivo) e CRISPR-Cas (ex vivo), un'altra caratteristica chiave della progettazione dei biomarcatori sintetici attivati dalla proteasi riguarda lo sfruttamento della farmacocinetica dei nanomateriali per aumentare la concentrazione del segnale diagnostico nei biofluidi¹⁰. Un approccio è l'uso di un vettore di nanoparticelle per aumentare il tempo di circolazione dei substrati peptidici coniugati in superficie. Un dendrimero di polietilenglicole (PEG) viene selezionato come nanovettore con diametro idrodinamico e multivalenza relativamente piccoli per aumentare la consegna ai tumori. Sebbene sia abbastanza piccolo da promuovere la somministrazione del tumore, la dimensione del vettore PEG è maggiore del cut-off di ~5 nm della barriera di filtrazione glomerulare renale in modo che solo i substrati peptidici scissi possano essere eliminati nelle urine, sfruttando la filtrazione dimensionale da parte dei reni¹². In questo protocollo, viene delineato il flusso di lavoro a più fasi per la sintesi e l'applicazione di nanosensori basati sull'attività con codice a barre del DNA in un modello murino preclinico, evidenziando la configurazione del test del biomarcatore urinario sintetico multianalita mediato da CRISPR-Cas, che è stato impiegato da questo gruppo per classificare lo stato della malattia in modelli murini di più tipi di cancro¹³. Grazie al principio di progettazione versatile, tutti e tre i componenti funzionali del nanosensore - il nanocarrier (polimero PEG), il modulo reattivo agli stimoli (substrato attivato dalla proteasi) e il reporter biofluidico (codice a barre del DNA) - possono essere scambiati con precisione in base alle esigenze specifiche dell'applicazione, consentendo la modularità adattando le specificità del target e del rilascio.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'istituto degli autori. Per eseguire correttamente questi esperimenti, sono necessarie strutture standard per la cura degli animali, tra cui camere di stabulazione, cappucci sterili, anestesia ed eutanasia etica. Tutti gli esperimenti sono condotti in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali e supervisionati dal personale veterinario dell'istituto. I topi femmina BALB/c, utilizzati per gli esperimenti, sono ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali) e avevano un'età compresa tra 6 e 8 settimane all'inizio dello studio. Le sequenze per DNA sintetizzato su misura, crRNA, sonde del substrato peptidico basato su FRET e peptidi sensore sono fornite nella Tabella supplementare 1.

1. Selezione del substrato peptidico attivato dalla proteasi

1. Raccogliere e preparare campioni di tessuto da polmone sano o tessuto polmonare con noduli tumorali a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato¹³.
   1. Omogeneizzare i tessuti in soluzione salina tamponata con fosfato pre-raffreddato (PBS, pH 7,4) (200 mg di tessuto/mL di PBS) con provette di dissociazione tissutale per la dissociazione automatizzata dei tessuti in sospensioni unicellulari.
   2. Centrifugare gli omogeneizzati di tessuto a 6.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Conservare il surnatante in una nuova provetta.
   3. Centrifugare il surnatante a 14.000 x g per 25 minuti a 4 °C.
   4. Misurare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il test delle proteine dell'acido bicinchoninico (BCA) (vedere la tabella dei materiali).
   5. Aggiungere PBS al campione per preparare una soluzione 0,33 mg/mL.
2. Valutare l'attività proteolitica seguendo i passaggi seguenti.
   1. In una piastra da 384 pozzetti, aggiungere sonde per substrato peptidico a base di FRET da 5 μL e 6 μM a ciascun pozzetto. Per ogni sonda, eseguire la reazione in triplice copia.
      NOTA: La sonda del substrato peptidico a base di FRET contiene una breve sequenza peptidica (6-8 amminoacidi, progettata per essere specifica per una proteasi bersaglio o un gruppo di proteasi) terminata con una coppia di fluorofori e quencher. Due sonde FRET sono descritte nella Tabella supplementare 1 come esempio. La libreria completa di sonde può essere trovata in Hao et al.^{Ore 13}.
   2. Centrifugare la piastra del pozzetto per 10 s a temperatura ambiente a 180 x g per assicurarsi che le sonde si trovino sul fondo della piastra.
   3. Aggiungere 25 μL di campione di tessuto 0,33 mg/mL o 40 μM di proteasi ricombinante¹³ in ciascun pozzetto.
      NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzare la concentrazione finale del campione di tessuto o della proteasi ricombinante in base alla loro attività proteolitica intrinseca. Ad esempio, i tessuti altamente proteolitici come l'intestino possono richiedere fattori di diluizione più elevati per consentire il monitoraggio della scissione enzimatica iniziale.
   4. Centrifugare brevemente la piastra del pozzetto a 180 x g (a temperatura ambiente) per miscelare le sonde e i lisati tissutali.
   5. Iniziare immediatamente a rilevare la sfaldatura della sonda misurando la fluorescenza con il lettore di piastre a 37 °C ogni 2 minuti per 1 ora (λ_ex: 485 nm; λ_em: 535 nm) per monitorare la scissione.
      NOTA: Utilizzare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per specifiche coppie di fluorofori e quencher. Nel caso di questo studio, i parametri (λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm) sono fissati per il fluoroforo FAM.
   6. Per analizzare i dati di misurazione della fluorescenza, utilizzare il pacchetto Python (vedere la tabella dei materiali) per l'analisi della cinetica enzimatica disponibile all'indirizzo https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Questo script calcola la velocità di reazione iniziale (V₀) utilizzando la pendenza dell'adattamento lineare dei primi 8-10 punti temporali iniziali.

2. Formulazione e caratterizzazione dei sensori

1. Sintetizzare il coniugato di DNA e peptide attivato dalla proteasi (PAP).
   1. Incubare reporter di DNA fosforotioato 20-mer con gruppo 3'-DBCO (1,1 eq., vedere Tabella dei materiali) con PAP con terminazione azidica con estremità cisteina C-terminale in tampone fosfato 100 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente per >4 ore. In caso di lasciare incubare per una notte a 4 °C.
   2. Purificare il prodotto su un sistema di cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) dotato di una colonna ideale per le biomolecole (vedi Tabella dei Materiali). Impostare il gradiente HPLC in modo che parta dal tampone 5% A (0,05% TFA in H₂O), mantenerlo isocratico per 20 minuti e raggiungere l'80% tampone B (0,05% TFA, 99,95% acetonitrile) a 65 minuti con una portata di 0,3 mL ^min-1 e raccogliere il prodotto coniugato con tempo di ritenzione a ~31 min.
   3. Convalidare i coniugati purificati mediante spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) utilizzando l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico come matrice¹⁴ (vedi Tabella dei materiali).
2. Sintetizzare i nanosensori basati sull'attività codificati dal DNA.
   1. Sciogliere 2 mg di PEG multivalente (40 kDa, 8 bracci, vedere Tabella dei materiali) con gruppo maleimmide-reattivo in 1 mL di tampone fosfato 100 mM (pH 7,0) e filtro (cutoff: 0,2 μm).
   2. Aggiungere i coniugati DNA-peptide terminati con cisteina (2 eq., vedi Tabella dei materiali) al PEG e reagire a temperatura ambiente per >4 ore. In caso di lasciare incubare per una notte a 4 °C.
   3. Rimuovere i materiali non coniugati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale con una colonna a matrice composita destrano-agarosio disponibile in commercio su una cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) (vedere Tabella dei materiali). Eseguire i campioni in PBS e monitorare l'assorbanza a 260 nm per il DNA e 280 nm per il peptide.
   4. Concentrare i nanosensori sintetizzati con tubi filtranti centrifughi (MWCO = 10 kDa) secondo la velocità consigliata dal produttore (vedi Tabella dei materiali).
   5. Quantificare la concentrazione di DNA utilizzando il kit del saggio ssDNA (vedere la tabella dei materiali) e un lettore di piastre a λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm. Conservare i nanosensori a 4 °C.
3. Caratterizzare i nanosensori basati sull'attività codificati dal DNA.
   1. Misurare la dimensione delle particelle idrodinamiche di nanosensori codificati nel DNA mediante diffusione dinamica della luce (DLS).
      NOTA: L'intervallo di dimensioni previsto dei nanosensori è di 15-50 nm, con una dimensione media di 20-30 nm. Se si desidera un intervallo di dimensioni limitato, è possibile utilizzare FPLC (nel passaggio 2.3) per isolare frazioni più strette con pesi molecolari diversi.
   2. Concentrare i nanosensori a 0,5 mg/mL (per concentrazione di DNA) con tubi filtranti centrifughi (MWCO = 10 kDa) e caricare i campioni su una griglia di rame rivestita con film di carbonio montata su un crioholder. Osservare la morfologia utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica (200 kV, ingrandimento di 10.000-60.000)¹⁴.

3. Iniezione del sensore e raccolta delle urine

1. Raccogliere l'urina per la misurazione del basale.
   1. Posizionare il mouse in una camera di alloggiamento personalizzata (vedere la Figura 1 supplementare) con una piastra a 96 pozzetti come base.
   2. Trattieni il mouse e applica una leggera pressione sulla vescica per eliminare l'urina residua sulla piastra.
   3. Pipettare l'urina raccolta (~100-200 μL) dalla piastra a 96 pozzetti in una provetta da 1,5 mL dopo aver riposizionato il topo nell'alloggiamento normale.
2. Stabilire un modello preclinico di tumore murino.
   1. Inoculare topi femmina BALB/c di età compresa tra 6 e 8 settimane mediante iniezione endovenosa con linea cellulare MC26-Fluc esprimente luciferasi (100k cellule/topo) (vedere Tabella dei materiali). Monitorare settimanalmente la progressione del tumore utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza in vivo .
      NOTA: Il carico tumorale visibile indicato dal segnale luminescente si verifica approssimativamente nella settimana 2 di iniezione di questa particolare linea cellulare. Controllare attentamente gli animali portatori di tumore durante la progressione del tumore su base regolare.
3. Iniettare nanosensori in diversi momenti dopo l'impianto del tumore.
   1. Preparare una soluzione iniettabile (volume massimo di 200 μL) contenente nanosensori a una concentrazione di 1 nmol mediante codice a barre del DNA in PBS sterile.
   2. Iniettare 200 μL di soluzione del sensore in PBS in ciascun topo sperimentale per via endovenosa.
4. Raccogliere campioni di urina da topi sani di controllo e portatori di tumore 1 ora dopo l'iniezione del sensore, come descritto nei passaggi 1.1-1.3.
   NOTA: I campioni di urina fresca possono essere processati per l'analisi del codice a barre del DNA direttamente o congelati immediatamente sul ghiaccio.

4. Rilevamento CRISPR di codici a barre del DNA: basato sulla fluorescenza

1. Utilizzare campioni di urina freschi o scongelare i campioni congelati sul ghiaccio. Centrifugare i campioni di urina a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Combinare i reagenti nella Tabella supplementare 2, aggiungere per ultimo l'enzima Cas12a (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù. Incubare la reazione a 37 °C per 30 min.
3. Eseguire la reazione reporter, come mostrato nella Tabella supplementare 3, in triplice copia utilizzando il prodotto del passaggio 2. Aggiungere la reazione del passaggio 2 per ultima e portarla rapidamente al lettore di piastre.
4. Rilevare l'attivazione di LbaCas12a misurando la fluorescenza con un lettore di piastre a 37 °C ogni 2 minuti per 3 ore (λ_ex: 485 nm e λ_em: 535 nm) per monitorare la cinetica di clivaggio del reporter del DNA.
5. Per analizzare i dati di misurazione della fluorescenza, utilizzare il pacchetto Python per l'analisi della cinetica enzimatica disponibile all'indirizzo https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Questo script calcola la velocità di reazione iniziale (V₀) utilizzando la pendenza dell'adattamento lineare dei primi 8-10 punti temporali iniziali.

5. Rilevamento CRISPR di codici a barre del DNA: su carta

1. Centrifugare i campioni di urina a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Eseguire i campioni di urina per il rilevamento CRISPR basato su fluorescenza e su carta in parallelo.
2. Combinare i reagenti indicati nella Tabella supplementare 2. Incubare a 37 °C per 30 min.
   NOTA: Questa fase di incubazione è identica a quella per la rilevazione CRISPR basata sulla fluorescenza.
3. Eseguire la reazione reporter utilizzando il reporter di DNA marcato con FAM-biotina per il saggio a flusso laterale su una striscia di carta (vedere Tabella dei materiali). Combinare i reagenti della Tabella supplementare 4 in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il prodotto della fase 2. Coprire con un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 1 h.
   NOTA: Selezionare il tempo di incubazione ottimale in base al monitoraggio cinetico in tempo reale nel test di rilevamento CRISPR basato sulla fluorescenza descritto sopra.
4. A un nuovo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 80 μL di PBS. Aggiungere 20 μL di campione della fase 3 a questo pozzetto.
5. Posizionare una striscia di carta a flusso laterale su ciascun pozzetto e attendere che il liquido raggiunga la parte superiore della striscia (<5 min). Cercare l'aspetto delle bande di controllo e/o dei campioni sulla striscia di carta.
6. Scatta una foto della striscia di flusso laterale e quantifica l'intensità della banda utilizzando ImageJ.

Risultati

Nomina di substrati peptidici attivati da proteasi
Per progettare sensori che riflettano i cambiamenti nell'attività proteolitica del tessuto, l'attività della proteasi nel tessuto viene innanzitutto caratterizzata utilizzando una libreria di sonde peptidiche¹³ (Figura 1). I campioni di tessuto freschi e congelati possono fornire informazioni sostanziali sull'attività proteolitica del microambiente tumorale combinando campioni di tessuto con son...

Discussione

Qui viene presentata una piattaforma altamente personalizzabile per il rilevamento multiplexato del cancro con un test delle urine portatile che valuta l'attività proteolitica associata alla malattia utilizzando un sensore iniettato minimamente invasivo. Quando viene attivata dalle proteasi tumorali, la scissione del substrato peptidico viene amplificata tramite il rilascio del codice a barre del DNA nelle urine. I reporter di DNA sintetico in un campione di urina possono essere letti da un'amplificazione enzim...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225