Prueba de biomarcadores de orina sintéticos multianalito mediada por CRISPR-Cas para diagnósticos portátiles

Resumen

Este protocolo describe una prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas que permite el diagnóstico del cáncer en el punto de atención a través del análisis ex vivo de las actividades de la proteasa asociadas al tumor.

Resumen

La creación de biomarcadores sintéticos para el desarrollo de diagnósticos de precisión ha permitido la detección de enfermedades a través de vías más allá de las utilizadas para las mediciones tradicionales de biofluidos. Los biomarcadores sintéticos generalmente hacen uso de reporteros que proporcionan señales legibles en el biofluido para reflejar las alteraciones bioquímicas en el microambiente local de la enfermedad durante la incidencia y progresión de la enfermedad. La concentración farmacocinética de los reporteros y la amplificación bioquímica de la señal de la enfermedad son primordiales para lograr una alta sensibilidad y especificidad en una prueba diagnóstica. Aquí, se construye una plataforma de diagnóstico de cáncer utilizando un formato de biomarcadores sintéticos: nanosensores basados en la actividad que llevan reporteros de ADN estabilizados químicamente que pueden ser liberados por firmas proteolíticas aberrantes en el microambiente tumoral. El ADN sintético como indicador de enfermedades ofrece la capacidad de multiplexación a través de su uso como código de barras, lo que permite la lectura de múltiples firmas proteolíticas a la vez. Los reporteros de ADN liberados en la orina se detectan utilizando nucleasas CRISPR a través de hibridación con ARN CRISPR, que a su vez producen una señal fluorescente o colorimétrica tras la activación enzimática. En este protocolo, se construyen nanosensores basados en la actividad y con código de barras de ADN, y su aplicación se ejemplifica en un modelo de ratón preclínico de cáncer colorrectal metastásico. Este sistema es altamente modificable de acuerdo con la biología de la enfermedad y genera múltiples señales de enfermedad simultáneamente, lo que permite una comprensión integral de las características de la enfermedad a través de un proceso mínimamente invasivo que solo requiere la administración de nanosensores, recolección de orina y una prueba en papel que permite el diagnóstico en el punto de atención.

Introducción

A pesar del importante esfuerzo realizado para identificar biomarcadores tumorales, como las proteínas de excreción y el ADN, el campo del diagnóstico del cáncer se ha visto afectado por su baja abundancia o rápida degradación^{en la} circulación. Como estrategia complementaria, los biomarcadores sintéticos de bioingeniería que responden selectivamente a las características de la enfermedad para generar señales amplificadas representan nuevas vías hacia diagnósticos precisos y accesibles ^2,3. Para ayudar a la detección, estos biomarcadores sintéticos aprovechan los mecanismos de activación dependientes del tumor, como la amplificación enzimática, para producir analitos con una mejor relación señal-ruido⁴. Aquí, una clase de enzimas asociadas al cáncer, las proteasas, se aprovechan para activar sensores inyectables a nanoescala para liberar indicadores de enfermedades detectables en los biofluidos como la sangre o la orina ^5,6. A la luz de la heterogeneidad tumoral, el desarrollo de un panel de sensores activados por proteasa permite realizar pruebas multianalito que combinan diferentes eventos de escisión de proteasas en una "firma de enfermedad" para evaluar la incidencia y la progresión del cáncer de una manera más específica y multiplexada.

Se han desarrollado biomarcadores sintéticos activados por proteasa que comprenden sustratos peptídicos conjugados con la superficie de un portador inerte⁷. Cuando se inyectan in vivo, estos péptidos son transportados al tumor, tras lo cual la escisión enzimática por las proteasas tumorales libera reporteros en la sangre o la orina para su detección. La detección multiplexada con biomarcadores sintéticos activados por proteasa requiere que cada biomarcador sintético dentro de un cóctel se etiquete con un código de barras molecular único. Con este fin, se han desarrollado varios enfoques, incluidos los códigos de barras de masa y los reporteros codificados por ligandos ^8,9,10. A diferencia de estos métodos de multiplexación, que pueden limitarse a unas pocas posibilidades de señal diferentes, el código de barras de ADN ofrece muchas más combinaciones de acuerdo con la alta complejidad y heterogeneidad de los estados de enfermedad humanos. Para ampliar la multiplexidad de los biomarcadores sintéticos, los sensores tienen un código de barras etiquetando cada reportero con una secuencia de ADN única para su detección a través de la nucleasa CRISPR-Cas para amplificar la señal biofluídica ex vivo. Estos códigos de barras de ADN monocatenario (ssDNA) están diseñados para unirse a ARN guía CRISPR (crRNA) complementarios, activando la actividad de la nucleasa colateral activada por el objetivo de CRISPR-Cas12a¹¹. Esta actividad nucleasa se puede emplear para escindir una cadena de ADN reportera detectada a través de la cinética de fluorescencia o utilizando tiras de papel.

Además de la amplificación molecular a través de proteasas (in vivo) y CRISPR-Cas (ex vivo), otra característica clave del diseño de los biomarcadores sintéticos activados por proteasa consiste en aprovechar la farmacocinética de nanomateriales para aumentar la concentración de señales diagnósticas en biofluidos¹⁰. Un enfoque es el uso de un portador de nanopartículas para aumentar el tiempo de circulación de sustratos peptídicos conjugados en superficie. Se selecciona un dendrímero de polietilenglicol (PEG) como nanotransportador con un diámetro hidrodinámico relativamente pequeño y multivalencia para aumentar la administración a los tumores. Si bien es lo suficientemente pequeño como para promover la entrega del tumor, el tamaño del portador de PEG es mayor que el límite de tamaño de ~ 5 nm de la barrera de filtración glomerular del riñón, de modo que solo los sustratos peptídicos escindidos pueden eliminarse en la orina, aprovechando la filtración de tamaño por parte de los riñones¹². En este protocolo, se describe el flujo de trabajo de varios pasos para la síntesis y aplicación de nanosensores basados en actividad con código de barras de ADN en un modelo murino preclínico, destacando la configuración de la prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas, que ha sido empleada por este grupo para clasificar el estado de la enfermedad en modelos murinos de múltiples tipos de cáncer¹³. Gracias al principio de diseño versátil, los tres componentes funcionales del nanosensor -el nanoportador (polímero PEG), el módulo sensible a estímulos (sustrato activado por proteasa) y el reportero biofluídico (código de barras de ADN)- pueden intercambiarse con precisión según las necesidades específicas de la aplicación, lo que permite la modularidad adaptando las especificidades del objetivo y la liberación.

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Protocolo

Todos los estudios en animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la institución de los autores. Para llevar a cabo correctamente estos experimentos, se requieren instalaciones estándar para el cuidado de animales, incluidas cámaras de alojamiento, capuchas estériles, anestesia y eutanasia ética de punto final. Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales y son supervisados por el personal veterinario de la institución. Los ratones hembra BALB/c, utilizados para los experimentos, se obtienen de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales) y su edad oscilaba entre 6 y 8 semanas al inicio del estudio. En la Tabla Suplementaria 1 se proporcionan secuencias para ADN sintetizado a medida, crRNA, sondas de sustrato peptídico basadas en FRET y péptidos sensores.

1. Selección del sustrato peptídico activado por proteasa

1. Recolectar y preparar muestras de tejido de pulmón sano o tejido pulmonar con nódulos tumorales siguiendo un informe publicado previamente¹³.
   1. Homogeneizar tejidos en solución salina tamponada con fosfato preenfriada (PBS, pH 7,4) (200 mg de tejido/mL de PBS) con tubos de disociación tisular para la disociación automatizada de tejidos en suspensiones unicelulares.
   2. El tejido de centrifugación homogeneiza a 6.000 x g durante 5 min a 4 °C. Retenga el sobrenadante en un tubo nuevo.
   3. Centrifugar el sobrenadante a 14.000 x g durante 25 min a 4 °C.
   4. Mida la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (consulte la tabla de materiales).
   5. Agregue PBS a la muestra para preparar una solución de 0,33 mg/ml.
2. Evalúe la actividad proteolítica siguiendo los pasos que se indican a continuación.
   1. En una placa de 384 pocillos, agregue 5 μL y 6 μM de sondas de sustrato peptídico a base de FRET a cada pocillo. Para cada sonda, realice la reacción por triplicado.
      NOTA: La sonda de sustrato peptídico basada en FRET contiene una secuencia peptídica corta (6-8 aminoácidos, diseñada para ser específica de una proteasa diana o grupo de proteasas) terminada con un par de fluoróforos y extintores. En la Tabla complementaria 1 se describen dos sondas FRET a modo de ejemplo. La biblioteca completa de sondas se puede encontrar en Hao et al.¹³.
   2. Centrifugar la placa de pocillos durante 10 s a temperatura ambiente a 180 x g para asegurarse de que las sondas estén en la parte inferior de la placa.
   3. Añadir 25 μL de muestra de tejido de 0,33 mg/mL o 40 μM de proteasa recombinante¹³ a cada pocillo.
      NOTA: Es posible que sea necesario optimizar la concentración final de la muestra de tejido o de la proteasa recombinante de acuerdo con su actividad proteolítica intrínseca. Por ejemplo, los tejidos altamente proteolíticos, como los intestinos, pueden requerir factores de dilución más altos para permitir el control de la escisión enzimática inicial.
   4. Centrifugar brevemente la placa del pocillo a 180 x g (a temperatura ambiente) para mezclar las sondas y los lisados de tejidos.
   5. Comience inmediatamente a detectar la escisión de la sonda midiendo la fluorescencia con el lector de placas a 37 °C cada 2 minutos durante 1 h (λ_ex: 485 nm; λ_em: 535 nm) para controlar la escisión.
      NOTA: Utilice las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para pares específicos de fluoróforos y extintores. En el caso de este estudio, se establecen parámetros (λ_ex: 485 nm y λ_em: 535 nm) para el fluoróforo FAM.
   6. Para analizar los datos de medición fluorescentes, utilice el paquete Python (consulte la Tabla de materiales) para el análisis cinético de enzimas disponible en https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula la velocidad de reacción inicial (V₀) utilizando la pendiente del ajuste lineal de los primeros 8-10 puntos de tiempo iniciales.

2. Formulación y caracterización de sensores

1. Sintetizar el conjugado de ADN y péptido activado por proteasa (PAP).
   1. Incubar reporteros de ADN fosforotiados de 20 meros con el grupo 3'-DBCO (1,1 eq., ver Tabla de Materiales) con PAPs terminados en azida con extremo de cisteína C-terminal en tampón fosfato de 100 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente durante >4 h. Si se deja pasar la noche, incubar a 4 °C.
   2. Purificar el producto en un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) equipado con una columna ideal para biomoléculas (ver Tabla de Materiales). Establezca el gradiente de HPLC para que comience con un tampón A del 5 % (0,05 % de TFA en H₂O), manténgalo isocrático durante 20 minutos y alcance el tampón B del 80 % (0,05 % de TFA, 99,95 % de acetonitrilo) a los 65 min con un caudal de 0,3 ml ^min-1, y recoja el producto conjugado con un tiempo de retención de ~31 min.
   3. Validar los conjugados purificados mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) utilizando ácido α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz¹⁴ (ver Tabla de Materiales).
2. Sintetizar los nanosensores basados en la actividad codificados por ADN.
   1. Disolver 2 mg de PEG multivalente (40 kDa, 8 brazos, ver Tabla de Materiales) con grupo reactivo a la maleimida en 1 mL de tampón fosfato 100 mM (pH 7,0) y filtro (punto de corte: 0,2 μm).
   2. Agregue los conjugados de péptido de ADN terminados en cisteína (2 eq., ver Tabla de materiales) al PEG y reaccione a temperatura ambiente durante >4 h. Si se deja pasar la noche, incubar a 4 °C.
   3. Eliminar los materiales no conjugados mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna de matriz compuesta de dextrán-agarosa disponible comercialmente en una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (ver Tabla de materiales). Realice muestras en PBS y controle la absorbancia a 260 nm para el ADN y a 280 nm para el péptido.
   4. Concentrar los nanosensores sintetizados con tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) de acuerdo con la velocidad recomendada por el fabricante (ver Tabla de Materiales).
   5. Cuantifique la concentración de ADN utilizando un kit de ensayo de ssDNA (ver Tabla de materiales) y un lector de placas a λ_ex: 485 nm y λ_em: 535 nm. Almacenar los nanosensores a 4 °C.
3. Caracterizar los nanosensores basados en la actividad codificados por ADN.
   1. Mida el tamaño de partícula hidrodinámico de los nanosensores codificados por ADN mediante dispersión dinámica de luz (DLS).
      NOTA: El rango de tamaño esperado de los nanosensores es de 15-50 nm, con un tamaño promedio de 20-30 nm. Si se desea un rango de tamaño limitado, se puede utilizar FPLC (en el paso 2.3) para aislar fracciones más estrechas con diferentes pesos moleculares.
   2. Concentrar los nanosensores a 0,5 mg/mL (por concentración de ADN) con tubos de filtro centrífugo (MWCO = 10 kDa) y cargar las muestras en una rejilla de cobre recubierta de película de carbono montada en un criosoporte. Observar la morfología mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica (200 kV, aumento de 10.000-60.000)¹⁴.

3. Inyección del sensor y recogida de orina

1. Recoja orina para la medición de referencia.
   1. Coloque el mouse en una cámara de alojamiento personalizada (consulte la Figura complementaria 1) con una placa de 96 pocillos como base.
   2. Sujete al ratón y aplique una presión suave sobre la vejiga para eliminar cualquier resto de orina en el plato.
   3. Pipetee la orina recolectada (~100-200 μL) de la placa de 96 pocillos en un tubo de 1,5 ml después de reemplazar el mouse a la carcasa normal.
2. Establecer un modelo tumoral murino preclínico.
   1. Inocular ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad mediante inyección intravenosa con la línea celular MC26-Fluc que expresa luciferasa (100k células/ratón) (ver Tabla de materiales). Monitorizar semanalmente la progresión tumoral mediante un sistema de imágenes de fluorescencia in vivo .
      NOTA: La carga tumoral visible indicada por la señal luminiscente ocurre aproximadamente en la semana 2 de la inyección de esta línea celular en particular. Revise cuidadosamente a los animales portadores de tumores durante la progresión del tumor de forma regular.
3. Inyectar nanosensores en diferentes momentos después de la implantación del tumor.
   1. Preparar una solución inyectable (volumen máximo de 200 μL) que contenga nanosensores a una concentración de 1 nmol mediante código de barras de ADN en PBS estéril.
   2. Inyectar 200 μL de solución de sensor en PBS en cada ratón experimental por vía intravenosa.
4. Recolecte muestras de orina de ratones control sanos y portadores de tumores 1 h después de la inyección del sensor, como se describe en los pasos 1.1-1.3.
   NOTA: Las muestras de orina fresca se pueden procesar directamente para el análisis de códigos de barras de ADN o congelarse inmediatamente en hielo.

4. Detección CRISPR de códigos de barras de ADN: basada en fluorescencia

1. Use muestras de orina frescas o descongele muestras congeladas en hielo. Centrifugar muestras de orina a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 2, agregue la enzima Cas12a (consulte la Tabla de Materiales) al final y mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 °C durante 30 min.
3. Ejecute la reacción del reportero, como se muestra en la Tabla suplementaria 3, por triplicado utilizando el producto del paso 2. Agregue la reacción del paso 2 al final y llévela rápidamente al lector de placas.
4. Detecte la activación de LbaCas12a midiendo la fluorescencia con un lector de placas a 37 °C cada 2 minutos durante 3 h (λ_ex: 485 nm y λ_em: 535 nm) para monitorizar la cinética de escisión del reportero de ADN.
5. Para analizar los datos de medición fluorescentes, utilice el paquete Python para el análisis cinético de enzimas disponible en https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula la velocidad de reacción inicial (V₀) utilizando la pendiente del ajuste lineal de los primeros 8-10 puntos de tiempo iniciales.

5. Detección CRISPR de códigos de barras de ADN: en papel

1. Centrifugar muestras de orina a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Ejecute las muestras de orina para la detección CRISPR basada en fluorescencia y en papel en paralelo.
2. Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Este paso de incubación es idéntico al de la detección CRISPR basada en fluorescencia.
3. Ejecute la reacción reportera utilizando un reportero de ADN marcado con FAM-biotina para el ensayo de flujo lateral en una tira de papel (consulte la Tabla de materiales). Combine los reactivos de la Tabla Suplementaria 4 en una placa de 96 pocillos utilizando el producto del paso 2. Cubrir con papel de aluminio e incubar a 37 °C durante 1 h.
   NOTA: Seleccione el tiempo de incubación óptimo de acuerdo con el monitoreo cinético en tiempo real en el ensayo de detección CRISPR basado en fluorescencia descrito anteriormente.
4. A un pocillo nuevo de una placa de 96 pocillos, agregue 80 μL de PBS. Agregue 20 μL de muestra del paso 3 a este pocillo.
5. Coloque una tira de papel de flujo lateral en cada pocillo y espere hasta que el líquido llegue a la parte superior de la tira (<5 min). Busque la apariencia de la(s) banda(s) de control y/o muestra(s) en la tira de papel.
6. Tome una foto de la franja de flujo lateral y cuantifique la intensidad de la banda con ImageJ.

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Resultados

Nominación de sustratos peptídicos activados por proteasa
Para diseñar sensores que reflejen los cambios en la actividad proteolítica del tejido, primero se caracteriza la actividad de la proteasa en el tejido utilizando una biblioteca de sondas peptídicas¹³ (Figura 1). Las muestras de tejido fresco y congelado pueden proporcionar información sustancial sobre la actividad proteolítica del microambiente tumoral mediante la combinación de mue...

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Discusión

Aquí se presenta una plataforma altamente personalizable para la detección multiplexada del cáncer con una prueba de orina portátil que evalúa la actividad proteolítica asociada a la enfermedad mediante un sensor inyectado mínimamente invasivo. Cuando es activada por las proteasas tumorales, la escisión del sustrato peptídico se amplifica a través de la liberación de códigos de barras de ADN en la orina. Los reporteros de ADN sintético en una muestra de orina se pueden leer mediante una amplificaci?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B6002SVIAL
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group	IDT		Custom DNA
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column	Agilent		HPLC
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC)	GE Healthcare		FPLC
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)	EMD millipore		Various volumes available
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine	CPC Scientific		Custom peptide
crRNAs	IDT		See Supplementary Table 1
Cryogenic transmission electron microscopy	JEM-2100F	JEOL	cyroTEM
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates	CPC Scientific		Custom peptide
Dynamic light scattering (DLS)			DLS
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM	New England Biolabs	M0653T
Experimental animals	Taconic Biosciences	BALB/cAnNTac	6–8 weeks of age
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	tissue homogenization
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit	Miltenyi Biotec	MGHD 1
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry	Bruker		Microflex MALDI–TOF
MC26-Fluc cell line			Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group	JenKem	A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g
Python, Version 3.9			https://www.python.org/
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent	Invitrogen	O11492	ssDNA assay kit
ssDNA FAM-T10-Quencher and  FAM-T10-Biotin reporter substrates	IDT		Custom DNA
Superdex 200 Increase 10/300 GL column	GE Healthcare	GE28-9909-44	For FPLC
Tecan Infinite Pro M200 plate reader	Tecan
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225