القياس الكمي للأجسام المضادة ذاتية التفاعل في الفئران عند التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

Summary

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني للتصلب المتعدد (MS) ، والذي يشترك مع المرض البشري في استجابة مناعة ذاتية خلطية قوية. هنا ، نبلغ عن بروتوكول ELISA بسيط ومرن لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران المحصنة EAE.

Abstract

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض يلخص اضطراب المناعة الذاتية التصلب المتعدد (MS) على المستويات النسيجية والجزيئية. يتم تحفيز EAE عن طريق تحصين التجارب عن طريق الحقن تحت الجلد من ببتيدات المايلين القصيرة مع مواد مساعدة محددة لتعزيز الاستجابة المناعية. مثل النظير البشري ، تصاب الفئران EAE بآفات مزيل للميالين ، وتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتنشيط الخلايا الدبقية وإصابة الخلايا العصبية. تدعم مجموعة متسقة من الأدلة أيضا دورا ميكانيكيا لخلل الخلايا البائية في مسببات كل من MS و EAE. يمكن أن تعمل الخلايا البائية كخلايا مقدمة لمولد الضد، وكذلك مصدرا أساسيا للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات والأجسام المضادة الذاتية. في EAE ، يتم إنشاء الأجسام المضادة ضد ببتيدات المايلين التي تم استخدامها للحث على المرض. وقد ثبت أن هذه الأجسام المضادة الذاتية تتوسط إما فقدان المايلين أو إعادة تنشيط الخلايا التائية المسببة للأمراض في الجهاز العصبي المركزي. توضح هذه المقالة بروتوكولا فعالا قائما على ELISA لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران C57BL / 6J المحصنة بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55). تعمل الطريقة المقترحة كأداة قوية للتحقيق في خصوصية وحجم الاستجابة الخلطية الشاذة في سياق إزالة الميالين المناعي الذاتي.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتميز بالتسلل البؤري للخلايا المناعية إلى حمة الدماغ ، وانهيار أغماد المايلين التي تغلف محاور عصبية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، وفقدان الخلايا العصبية¹. بالإضافة إلى الدور الراسخ للخلايا التائية المسببة للأمراض ، سلطت خطوط متعددة من الأدلة الضوء على تورط الخلايا البائية في التوسط في استجابة المناعة الذاتية ضد الجهاز العصبي المركزي. تخضع الخلايا البائية للتوسع النسيلي في دماغ مرض التصلب العصبي المتعدد وتم اكتشاف الأجسام المضادة ضد مكونات المايلين داخل الآفات المنزوعة الميالين ^2,3. تم مؤخرا توثيق التنشيط الانتقائي ....

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية التجريبية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة شرق كارولينا (IACUC). تم استخدام إناث الفئران Wildtype C57BL / 6J بين 8-10 أسابيع من العمر في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تحفيز EAE بعد التقارير المنشورة سابقا^12،13،14.

1. جمع المصل

1. القتل الرحيم للفأر التجريبي عن طريق الاختناق CO₂ أو جرعة زائدة من الأيزوفلوران في النقطة الزمنية المطلوبة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) بعد ت....

النتائج

لإثبات متانة اختبار ELISA الحالي ، تم اختبار الطريقة على عينات المصل المعزولة من مجموعة من الفئران الإناث C57BL / 6J في 20 يوما بعد التحصين (dpi) مع 100 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) بعد بروتوكول تحريض EAE تم التحقق من صحته^12،13،14. .......

Discussion

هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وفعال قائم على ELISA لتحديد الاستجابة الخلطية بدقة في نموذج حيواني ذي صلة لأمراض التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لوصف الدور الجديد لبروتين ataxin-1 في التحكم في مستويات مصل الأجسام المضادة الذاتية في نموذج MOG35-55 / C57BL6J EAE¹². في هذا ا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531