JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني للتصلب المتعدد (MS) ، والذي يشترك مع المرض البشري في استجابة مناعة ذاتية خلطية قوية. هنا ، نبلغ عن بروتوكول ELISA بسيط ومرن لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران المحصنة EAE.

Abstract

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض يلخص اضطراب المناعة الذاتية التصلب المتعدد (MS) على المستويات النسيجية والجزيئية. يتم تحفيز EAE عن طريق تحصين التجارب عن طريق الحقن تحت الجلد من ببتيدات المايلين القصيرة مع مواد مساعدة محددة لتعزيز الاستجابة المناعية. مثل النظير البشري ، تصاب الفئران EAE بآفات مزيل للميالين ، وتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتنشيط الخلايا الدبقية وإصابة الخلايا العصبية. تدعم مجموعة متسقة من الأدلة أيضا دورا ميكانيكيا لخلل الخلايا البائية في مسببات كل من MS و EAE. يمكن أن تعمل الخلايا البائية كخلايا مقدمة لمولد الضد، وكذلك مصدرا أساسيا للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات والأجسام المضادة الذاتية. في EAE ، يتم إنشاء الأجسام المضادة ضد ببتيدات المايلين التي تم استخدامها للحث على المرض. وقد ثبت أن هذه الأجسام المضادة الذاتية تتوسط إما فقدان المايلين أو إعادة تنشيط الخلايا التائية المسببة للأمراض في الجهاز العصبي المركزي. توضح هذه المقالة بروتوكولا فعالا قائما على ELISA لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران C57BL / 6J المحصنة بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55). تعمل الطريقة المقترحة كأداة قوية للتحقيق في خصوصية وحجم الاستجابة الخلطية الشاذة في سياق إزالة الميالين المناعي الذاتي.

Introduction

التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتميز بالتسلل البؤري للخلايا المناعية إلى حمة الدماغ ، وانهيار أغماد المايلين التي تغلف محاور عصبية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، وفقدان الخلايا العصبية1. بالإضافة إلى الدور الراسخ للخلايا التائية المسببة للأمراض ، سلطت خطوط متعددة من الأدلة الضوء على تورط الخلايا البائية في التوسط في استجابة المناعة الذاتية ضد الجهاز العصبي المركزي. تخضع الخلايا البائية للتوسع النسيلي في دماغ مرض التصلب العصبي المتعدد وتم اكتشاف الأجسام المضادة ضد مكونات المايلين داخل الآفات المنزوعة الميالين 2,3. تم مؤخرا توثيق التنشيط الانتقائي للخلايا البائية المحيطية في بداية المرض ، مما يشير إلى دور مفترض لحجرة الخلايا المناعية هذه في بدء المرض أيضا4. يؤكد نجاح العلاجات المستنفدة للخلايا البائية مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل CD20 العلاقة الميكانيكية بين عمل الخلايا البائية الشاذة وإزالة الميالين المناعي الذاتي 5,6. من وجهة نظر جزيئية، يمكن أن تسهم الخلايا البائية في الإصابة بالمرض عن طريق عرض مولد الضد الذاتي، وإفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات، وإنتاج الأجسام المضادة ذاتية التفاعل.

تم تطوير نماذج حيوانية متعددة لتلخيص السمات المحددة للنمط الظاهري المعقد لمرض التصلب العصبي المتعدد. من بينها ، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو الأكثر استخداما في نموذج الجسم الحي ويعتمد على تحصين التجارب بالببتيدات القصيرة المشتقة من بروتينات المايلين مثل البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) وبروتين المايلين الأساسي (MBP)7. تطور المحصنة EAE أمراضا مزيل للميالين تشبه مرض التصلب العصبي المتعدد في العديد من الجوانب ، بما في ذلك الاستجابة الخلطية القوية ضد الببتيدالدماغي 8. لهذا السبب ، كانت دراسات EAE مفيدة في تشريح وظيفة الخلايا البائية والأجسام المضادة الذاتية في سياق المرض. على سبيل المثال ، ثبت أن الأجسام المضادة الخاصة ب MOG المعزولة من مرضى التصلب العصبي المتعدد يمكن أن تؤدي إلى تفاقم المسار السريري في نماذج EAE9. والجدير بالذكر أن بقايا البرولين في الموضع 42 في MOG البشري تبين أنها حاسمة لتحديد إمراضية الأجسام المضادةالذاتية 10. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على الأجسام المضادة الذاتية الخاصة ب MOG لتعزيز المرض ليس فقط عن طريق التوسط في فقدان المايلين ولكن أيضا عن طريق تعزيز إعادة تنشيط الخلايا التائية ذاتية التفاعل داخل الجهاز العصبيالمركزي 11.

بالنظر إلى أهمية استجابات الأجسام المضادة في المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا قائما على ELISA لقياس مستويات مصل الأجسام المضادة ذاتية التفاعل بكفاءة في الفئران C57BL / 6J EAE المحصنة بببتيد MOG35-55. في الجزء الأول من البروتوكول ، سيتم وصف طريقة جمع المصل عن طريق ثقب داخل القلب. بعد ذلك ، سيتم تفصيل إجراءات إعداد اختبار ELISA والحصول على البيانات. أخيرا ، سيتم مناقشة تحليل البيانات وتفسيرها.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية التجريبية المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة شرق كارولينا (IACUC). تم استخدام إناث الفئران Wildtype C57BL / 6J بين 8-10 أسابيع من العمر في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تحفيز EAE بعد التقارير المنشورة سابقا12،13،14.

1. جمع المصل

  1. القتل الرحيم للفأر التجريبي عن طريق الاختناق CO2 أو جرعة زائدة من الأيزوفلوران في النقطة الزمنية المطلوبة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) بعد تحفيز EAE عبر التحصين MOG35-55.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف العدد الإجمالي للفئران والنقاط الزمنية لجمع المصل وفقا للتجربة المحددة.
  2. بعد تأكيد عدم وجود علامات حيوية عن طريق قرصة إصبع القدم أو الذيل ، ضع الماوس في وضع الاستلقاء الظهري على صينية تشريح وألصق الأطراف في موضعها بدبابيس أو شريط. قم بتوجيه جسم الماوس إلى مصدر ضوء LED (انظر جدول المواد) لإلقاء الضوء على صدر.
  3. رش فرو الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بعمل شق في خط الوسط من 3-4 سم على طول البطن من الحوض إلى الخنجري باستخدام مقص التشريح ، مع الحرص على تجنب أي أعضاء وأوعية رئيسية (الشكل 1A-C). لتسهيل الإجراء ، استخدم الملقط للإمساك بالجلد فوق عملية الخنجري.
  4. قطع الحجاب الحاجز بشكل جانبي ثم قطع القفص الصدري من الأمام على كلا الحواف الجانبية باستخدام مقص الربيع ، والتوقف قبل الوصول إلى القص عند خط الوسط (الشكل 1 د). قم بطي رفرف الضلع الذي تم إنشاؤه فوق رأس الماوس لكشف القلب (الشكل 1E).
    ملاحظة: يجب تجنب قطع القص لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الشرايين الصدرية الرئيسية المجاورة للعظم وتقليل حجم الدم الذي يمكن جمعه.
  5. أدخل إبرة 25 G متصلة بحقنة 1 مل في البطين الأيسر واجمع الدم عن طريق سحب المكبس برفق (الشكل 1F). لتسهيل ثقب الإبرة، ثبت القلب برفق ضد زوج من الملقط.
    ملاحظة: إذا لم يظهر الدم على الفور في المحقنة ، فيجب تدوير الإبرة ببطء ، ويجب اختبار زاوية مختلفة. ومع ذلك ، يجب بذل الجهود لوضع الإبرة بشكل صحيح في المحاولة الأولى لتجنب إنشاء ثقوب غير ضرورية في القلب حيث يمكن أن يتسرب الدم.
  6. انقل الدم إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل واتركه يتجلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الجلطة عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، التي تمثل جزء المصل ، وقم بتخزين القسامات ذات الاستخدام الواحد في أنابيب مبردة عند -80 درجة مئوية للاختبار في المستقبل.

2. مقايسة إليسا

  1. أعد تعليق الببتيد MOG35-55 المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) في الماء للحصول على مخزون 10 مجم / مل. قبل البدء في التجربة ، قم بتخفيف المخزون إلى 10 ميكروغرام / مل في محلول الطلاء (انظر جدول المواد) وماصة 100 ميكرولتر / بئر من المحلول النهائي في لوحة 96 بئرا. أغلق اللوحة بغشاء لاصق لتجنب التبخر واحتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب حساب بئرين على الأقل لكل عينة ويجب أيضا تضمين بئرين إضافيين للتحكم الفارغ.
  2. في موازاة ذلك ، قم بتغطية نفس العدد من الآبار ب 100 ميكرولتر / بئر من ألبومين مصل الأبقار (BSA) المذاب في محلول الطلاء بتركيز 10 ميكروغرام / مل. ستكون هذه الآبار الإضافية بمثابة عناصر تحكم في الخلفية.
    ملاحظة: يوصى بطلاء آبار التحكم باستخدام BSA نظرا لأن الطلاء والمخازن المؤقتة للحظر لها تركيبات مختلفة. يرجى ملاحظة أنه يمكن استخدام الببتيدات الدماغية الأخرى (مثل PLP139-151 أو MBP84-104) كمستضدات غير ذات صلة كبديل ل BSA.
  3. في اليوم التالي ، اغسل الطبق 3 مرات ب 200 ميكرولتر / بئر من محلول ملحي عازل للفوسفات مكمل ب 0.05٪ توين 20 (PBS-T). بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر / بئر من محلول مانع مصنوع من 3٪ BSA في PBS (بدون Tween 20) واحتضان اللوحة محكمة الغلق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن التهجين.
  4. اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. خفف كل عينة مصل 1: 100 في محلول مانع وأضف 100 ميكرولتر / بئر إلى كل من الآبار المطلية ب MOG35-55 و BSA. أضف نفس الحجم من محلول الحجب إلى الآبار المخصصة كفراغات. احتضان اللوحة مختومة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز مستمر (250 دورة في الدقيقة).
  5. اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP (1: 2000 ، انظر جدول المواد) في محلول مصنوع من 0.2٪ BSA في PBS-T وأضف 100 ميكرولتر / بئر إلى جميع الآبار. احتضان اللوحة مختومة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز مستمر (250 دورة في الدقيقة).
  6. اغسل الطبق 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر / بئر من PBS-T. أضف 100 ميكرولتر / بئر من ركيزة 3,3 '، 5,5' رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) (انظر جدول المواد) إلى جميع الآبار واحتضانها في الظلام لمدة 1-5 دقائق ، ومراقبة تطور اللون الأزرق.
    1. أوقف التفاعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر / بئر من محلول التوقف (انظر جدول المواد) وقياس الكثافة الضوئية (OD) في كل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوط بطول موجي 450 نانومتر.
      ملاحظة: يجب موازنة ركيزة TMB في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة قبل إضافتها إلى الآبار.

3. تحليل البيانات

  1. قم بتعبئة جدول بيانات Excel بقيم OD المقروءة من اللوحة. متوسط قيم OD التي تم الحصول عليها من الآبار المكررة (كل من MOG35-55 و BSA المغلفة) لكل عينة.
  2. لكل عينة ، اطرح متوسط قيمة الآبار المطلية ب BSA من قيمة الآبار المطلية MOG35-55. ستكون القيم المصححة الناتجة متناسبة مع تركيز الأجسام المضادة المضادة ل MOG35-55 في عينات المصل المختلفة.
    ملاحظة: يجب أن تؤدي الآبار الفارغة إلى قيم مصححة حول 0.
  3. قم بتطبيق اختبار إحصائي غير معلمي مثل اختبار Mann-Whitney U لمقارنة متوسط قيم OD بين حالتين تجريبيتين. قم بتضمين 3 عينات مستقلة على الأقل لكل حالة.

النتائج

لإثبات متانة اختبار ELISA الحالي ، تم اختبار الطريقة على عينات المصل المعزولة من مجموعة من الفئران الإناث C57BL / 6J في 20 يوما بعد التحصين (dpi) مع 100 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 في مساعد فرويند الكامل (CFA) بعد بروتوكول تحريض EAE تم التحقق من صحته12،13،14. ...

Discussion

هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وفعال قائم على ELISA لتحديد الاستجابة الخلطية بدقة في نموذج حيواني ذي صلة لأمراض التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لوصف الدور الجديد لبروتين ataxin-1 في التحكم في مستويات مصل الأجسام المضادة الذاتية في نموذج MOG35-55 / C57BL6J EAE12. في هذا ا...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R03NS131908) ووزارة الدفاع من خلال برنامج أبحاث التصلب المتعدد بموجب الجائزة رقم W81XWH-22-1-0517. الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلف ولا تقرها بالضرورة وزارة الدفاع. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل صناديق بدء التشغيل بجامعة شرق كارولينا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringesBD Biosciences309628
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher05-408-129
25 G needlesBD Biosciences305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrateThermo FisherN301Store at 4 °C
Adhesive sealsThermo FisherAB0558
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906Store at 4 °C
C57BL/6J female miceThe Jackson Laboratory000664Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubesFisher10-500-25
Dissection trayFisherS111022
Dissector scissorsFine Science Tools14082-09
ELISA coating bufferBioLegend421701Store at 4°C
Excel softwareMicrosoftAnalysis spreadsheet
ForcepsFine Science Tools11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRPSouthernBiotech1030-05Store at 4 °C
LED light sourceFisherAMPSILED21
Microplate readerFisher14-377-575 
Molecular biology grade waterCorning46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptideEZBiolabcp7203Store at -80 °C
Multichannel pipetteAxygenAP-12-200-P
Noyes spring scissorsFine Science Tools15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well platesBioLegend423501
Orbital shakerFisher88-861-023
OvenVWR445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)Thermo Fisher14190144
Refrigerated tabletop centrifugeThermo Fisher75002441
Stop solutionThermo FisherN600
Tween 20Bio-Rad1706531

References

  1. Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
  2. Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
  3. Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
  4. Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
  5. Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
  6. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
  7. Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
  8. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  9. Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
  10. Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
  11. Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
  12. Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
  13. Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
  14. Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
  15. Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved