Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal¹. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (IACUC). En este estudio se utilizaron ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La EAE fue inducida a partir de los reportes previamente publicados 12,13,14.

1. Colección de sérums

1. Eutanasia del ratón e....

Discusión

Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE¹². En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531