Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal¹. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de las lesiones desmielinizadas ^2,3. Recientemente se ha documentado la activación selectiva de las células B periféricas al inicio de la enfermedad, lo que sugiere un papel putativo de este compartimento de células inmunitarias también en el inicio de la enfermedad⁴. El éxito de las terapias de agotamiento de linfocitos B, como los anticuerpos monoclonales anti-CD20, corrobora aún más la conexión mecanicista entre el funcionamiento aberrante de los linfocitos B y la desmielinización autoinmune ^5,6. Desde un punto de vista molecular, las células B pueden contribuir a la enfermedad a través de la presentación de autoantígenos, la secreción de citocinas proinflamatorias y la producción de anticuerpos autorreactivos.

Se han desarrollado múltiples modelos animales para recapitular las características específicas del complejo fenotipo de la EM. Entre ellos, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el paradigma in vivo más utilizado y se basa en la inmunización de animales de experimentación con péptidos cortos derivados de proteínas de mielina como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) y la proteína básica de mielina (MBP)⁷. Los animales inmunizados con EAE desarrollan una patología desmielinizante que se asemeja a la EM en muchos aspectos, incluyendo una respuesta humoral robusta frente al péptido encefalogénico⁸. Por este motivo, los estudios de EAE han sido fundamentales para diseccionar la función de las células B y los autoanticuerpos en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se demostró que los anticuerpos específicos de MOG aislados de pacientes con EM pueden agravar el curso clínico en modelos EAE⁹. En particular, se demostró que el residuo de prolina en la posición 42 en el MOG humano es crítico para determinar la patogenicidad de los autoanticuerpos¹⁰. Más recientemente, se ha descubierto que los autoanticuerpos específicos de MOG promueven la enfermedad no solo al mediar la pérdida de mielina, sino también al estimular la reactivación de las células T autorreactivas dentro del SNC¹¹.

Teniendo en cuenta la importancia de las respuestas de anticuerpos en la autoinmunidad del SNC, este artículo presenta un protocolo basado en ELISA para medir de manera eficiente los niveles séricos de anticuerpos autorreactivos en ratones C57BL/6J EAE inmunizados con el péptido MOG35-55. En la primera parte del protocolo se describirá el método de recogida de suero mediante punción intracardíaca. Posteriormente, se detallarán los procedimientos para configurar el ensayo ELISA y adquirir los datos. Por último, se discutirá el análisis e interpretación de los datos.

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (IACUC). En este estudio se utilizaron ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La EAE fue inducida a partir de los reportes previamente publicados 12,13,14.

1. Colección de sérums

1. Eutanasia del ratón experimental mediante asfixia por CO₂ o sobredosis de isoflurano en el momento requerido (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) después de inducir EAE mediante inmunización MOG35-55.
   NOTA: El número total de ratones y los puntos de tiempo para la recolección de suero pueden variar según el experimento específico.
2. Después de que se confirme la ausencia de signos vitales mediante un pellizco en la punta del pie o la cola, coloque el ratón en posición de decúbito dorsal en una bandeja de disección y fije las extremidades en su posición con alfileres o cinta adhesiva. Oriente el cuerpo del ratón hacia la fuente de luz LED (ver Tabla de materiales) para iluminar el tórax del animal.
3. Rocíe el pelaje del ratón con etanol al 70% y haga una incisión en la línea media de 3-4 cm a lo largo del abdomen desde la pelvis hasta el xifoides con las tijeras de disector, teniendo cuidado de evitar cualquier órgano y vasos principales (Figura 1A-C). Para facilitar el procedimiento, use las pinzas para agarrar la piel sobre la apófisis xifoides.
4. Corte el diafragma lateralmente y luego corte la caja torácica anteriormente en ambos bordes laterales con las tijeras de resorte, deteniéndose antes de llegar al esternón en la línea media (Figura 1D). Dobla la solapa de la costilla que se creó sobre la cabeza del ratón para exponer el corazón (Figura 1E).
   NOTA: Se debe evitar cortar el esternón, ya que esto dañará las arterias torácicas principales que se encuentran adyacentes al hueso y reducirá el volumen de sangre que se puede recolectar.
5. Inserte una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 1 ml en el ventrículo izquierdo y recoja la sangre tirando suavemente del émbolo hacia atrás (Figura 1F). Para facilitar la punción de la aguja, sujete suavemente el corazón contra un par de fórceps.
   NOTA: Si la sangre no aparece inmediatamente en la jeringa, la aguja debe girarse lentamente y se debe probar un ángulo diferente. Sin embargo, se deben hacer esfuerzos para colocar la aguja correctamente en el primer intento para evitar crear orificios innecesarios en el corazón donde la sangre pueda filtrarse.
6. Transfiera la sangre a un tubo estéril de 1,5 ml y deje que coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el coágulo por centrifugación a 2000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante, que representa la fracción sérica, y almacene las alícuotas de un solo uso en tubos criogénicos a -80 °C para futuras pruebas.

2. Ensayo ELISA

1. Vuelva a suspender el péptido MOG35-55 liofilizado (ver Tabla de Materiales) en agua para obtener un stock de 10 mg/mL. Antes de comenzar el experimento, diluya el stock a 10 μg/mL en tampón de recubrimiento (consulte la Tabla de materiales) y pipetee 100 μL/pocillo de la solución final en una placa de 96 pocillos. Selle la placa con una película adhesiva para evitar la evaporación e incube la placa durante la noche a 4 °C.
   NOTA: Se deben calcular al menos 2 pocillos para cada muestra y también se deben incluir 2 pocillos adicionales para un control en blanco.
2. Paralelamente, cubra el mismo número de pocillos con 100 μL/pocillo de albúmina sérica bovina (BSA) disuelta en el tampón de recubrimiento a una concentración de 10 μg/mL. Estos pozos adicionales servirán como controles de fondo.
   NOTA: Se recomienda recubrir con BSA los pozos de control ya que los tampones de recubrimiento y bloqueo tienen diferentes composiciones. Tenga en cuenta que otros péptidos encefalogénicos (como PLP139-151 o MBP84-104) podrían usarse como antígenos irrelevantes en alternativa a BSA.
3. Al día siguiente, lavar la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de solución salina tampón fosfato suplementado con Tween 20 al 0,05% (PBS-T). A continuación, añadir 100 μL/pocillo de una solución de bloqueo compuesta por BSA al 3% en PBS (sin Tween 20) e incubar la placa sellada durante 1 h a 37 °C en un horno de hibridación.
4. Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir cada muestra de suero 1:100 en solución de bloqueo y añadir 100 μL/pocillo a los pocillos recubiertos de MOG35-55 y BSA. Agregue el mismo volumen de solución de bloqueo a los pozos designados como espacios en blanco. Incubar la placa sellada durante 2 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).
5. Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:2000, ver Tabla de Materiales) en una solución hecha de BSA al 0,2% en PBS-T y añadir 100 μL/pocillo a todos los pocillos. Incubar la placa sellada durante 1 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).
6. Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Agregue 100 μL/pocillo de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) de 3,3',5,5' (ver Tabla de Materiales) a todos los pocillos e incube en la oscuridad durante 1-5 min, monitoreando el desarrollo de un color azul.
   1. Detenga la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de solución de parada (consulte la Tabla de materiales) y mida la densidad óptica (OD) en cada pocillo utilizando un lector de placas configurado a una longitud de onda de 450 nm.
      NOTA: El sustrato de TMB debe equilibrarse a temperatura ambiente durante 30-60 minutos antes de añadirlo a los pocillos.

3. Análisis de datos

1. Rellene una hoja de cálculo de Excel con los valores OD leídos de la placa. Promedie los valores de OD obtenidos de pocillos duplicados (tanto recubiertos con MOG35-55 como con BSA) para cada muestra.
2. Para cada muestra, reste el valor medio de los pocillos recubiertos de BSA del de los pocillos recubiertos de MOG35-55. Los valores de fondo corregidos resultantes serán proporcionales a la concentración de anticuerpos anti-MOG35-55 en las diferentes muestras de suero.
   NOTA: Los pozos en blanco deben dar como resultado valores corregidos alrededor de 0.
3. Aplique una prueba estadística no paramétrica, como la prueba U de Mann-Whitney, para comparar los valores promedio de OD entre dos condiciones experimentales. Incluya al menos 3 muestras independientes para cada condición.

Resultados

Para demostrar la robustez del presente ensayo ELISA, el método se probó en muestras de suero aisladas de una cohorte de ratones hembra C57BL/6J a los 20 días después de la inmunización (dpi) con 100 μg del péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA) siguiendo un protocolo de inducción EAE validado 12,13,14. Los animales también recibieron 400 ng de toxina para la tos ferina los días 0 y 2. Las muestras de s...

Discusión

Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE¹². En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531