Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), otoimmün hastalık multipl sklerozu (MS) histopatolojik ve moleküler düzeyde özetleyen bir hastalık modelidir. EAE, immün yanıtı artırmak için spesifik adjuvanlarla birlikte kısa miyelin peptitlerinin deri altı enjeksiyonu yoluyla deney hayvanlarının aşılanmasıyla indüklenir. İnsan muadili gibi, EAE fareleri de demiyelinizan lezyonlar, merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu, glia aktivasyonu ve nöronal hasar geliştirir. Tutarlı bir kanıt grubu, hem MS hem de EAE'nin etiyolojisinde B hücre disfonksiyonu için mekanik bir rolü desteklemektedir. B hücreleri, antijen sunan hücrelerin yanı sıra birincil proinflamatuar sitokinler ve otoantikor kaynağı olarak da hizmet edebilir. EAE'de, hastalığı indüklemek için kullanılan miyelin peptitlerine karşı antikorlar üretilir. Bu tür otoantikorların, CNS'ye miyelin kaybına veya patojenik T hücresi reaktivasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu makale, miyelin oligodendrosit glikoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidi ile aşılanmış C57BL/6J farelerinin serumundaki otoantikorları ölçmek için etkili bir ELISA tabanlı protokolü açıklamaktadır. Önerilen yöntem, otoimmün demiyelinizasyon bağlamında anormal humoral yanıtın özgüllüğünü ve büyüklüğünü araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.

Giriş

Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin beyin parankimine fokal infiltrasyonu, aksonları saran miyelin kılıflarının parçalanması, glia aktivasyonu ve nöronal kayıp ile karakterize merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik otoimmün bir hastalığıdır¹. Patojenik T hücrelerinin iyi bilinen rolüne ek olarak, çok sayıda kanıt, B hücrelerinin CNS'ye karşı otoimmün tepkiye aracılık etmede rol oynadığını vurgulamıştır. B hücreleri MS beyninde klonal genişlemeye uğrar ve demiyelinize lezyonlarda miyelin bileşenlerine karşı antikorlar tespit edilmiştir ^2,3. Hastalık başlangıcında periferik B hücrelerin....

Protokol

Fareleri içeren tüm prosedürler, Doğu Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan deneysel kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık yaşları arasında vahşi tip C57BL/6J dişi fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. EAE, daha önce yayınlanmış ^12,13,14 raporlarını takiben indüklenmiştir.

1. Serum toplama

1. Deney faresini, MOG35-55 bağışıklaması yoluyla EAE'yi indükledikten sonra gerekli zam....

Tartışmalar

Burada, MS patolojisinin ilgili bir hayvan modelinde humoral yanıtı doğru bir şekilde ölçmek için basit ve etkili bir ELISA tabanlı protokol bildirilmiştir. Bu yöntem, MOG35-55 / C57BL6J EAE paradigma^12'deki otoantikorların serum seviyelerini kontrol etmede ataksin-1 proteininin yeni rolünü tanımlamak için yakın zamanda kullanılmıştır. Bu bağlamda, bu yöntemle tutarlı ve biyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için bir dizi faktör göz önünde bulundurulmalıdır.<.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531