Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Özet

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), otoimmün hastalık multipl sklerozu (MS) histopatolojik ve moleküler düzeyde özetleyen bir hastalık modelidir. EAE, immün yanıtı artırmak için spesifik adjuvanlarla birlikte kısa miyelin peptitlerinin deri altı enjeksiyonu yoluyla deney hayvanlarının aşılanmasıyla indüklenir. İnsan muadili gibi, EAE fareleri de demiyelinizan lezyonlar, merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu, glia aktivasyonu ve nöronal hasar geliştirir. Tutarlı bir kanıt grubu, hem MS hem de EAE'nin etiyolojisinde B hücre disfonksiyonu için mekanik bir rolü desteklemektedir. B hücreleri, antijen sunan hücrelerin yanı sıra birincil proinflamatuar sitokinler ve otoantikor kaynağı olarak da hizmet edebilir. EAE'de, hastalığı indüklemek için kullanılan miyelin peptitlerine karşı antikorlar üretilir. Bu tür otoantikorların, CNS'ye miyelin kaybına veya patojenik T hücresi reaktivasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu makale, miyelin oligodendrosit glikoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidi ile aşılanmış C57BL/6J farelerinin serumundaki otoantikorları ölçmek için etkili bir ELISA tabanlı protokolü açıklamaktadır. Önerilen yöntem, otoimmün demiyelinizasyon bağlamında anormal humoral yanıtın özgüllüğünü ve büyüklüğünü araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.

Giriş

Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin beyin parankimine fokal infiltrasyonu, aksonları saran miyelin kılıflarının parçalanması, glia aktivasyonu ve nöronal kayıp ile karakterize merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik otoimmün bir hastalığıdır¹. Patojenik T hücrelerinin iyi bilinen rolüne ek olarak, çok sayıda kanıt, B hücrelerinin CNS'ye karşı otoimmün tepkiye aracılık etmede rol oynadığını vurgulamıştır. B hücreleri MS beyninde klonal genişlemeye uğrar ve demiyelinize lezyonlarda miyelin bileşenlerine karşı antikorlar tespit edilmiştir ^2,3. Hastalık başlangıcında periferik B hücrelerinin seçici aktivasyonu yakın zamanda belgelenmiştir, bu da bu bağışıklık hücresi bölmesinin hastalığın başlangıcında da varsayılan bir rol oynadığını düşündürmektedir⁴. Anti-CD20 monoklonal antikorları gibi B hücresini tüketen tedavilerin başarısı, anormal B hücresi fonksiyonu ile otoimmün demiyelinizasyon^arasındaki mekanik bağlantıyı daha da doğrulamaktadır ^5,6. Moleküler açıdan bakıldığında, B hücreleri otoantijen sunumu, proinflamatuar sitokin sekresyonu ve otoreaktif antikor üretimi yoluyla hastalığa katkıda bulunabilir.

Karmaşık MS fenotipinin spesifik özelliklerini özetlemek için çoklu hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) en yaygın kullanılanıdır in vivo paradigma ve deney hayvanlarının miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) ve miyelin bazik proteini (MBP) gibi miyelin proteinlerinden türetilen kısa peptitlerle aşılanmasına ^dayanır7. EAE ile aşılanmış hayvanlar, ensefalitojenik peptit^8'e karşı sağlam bir humoral yanıt da dahil olmak üzere birçok yönden MS'e benzeyen demiyelinizan bir patoloji geliştirir. Bu nedenle, EAE çalışmaları, hastalık bağlamında B hücrelerinin ve otoantikorların fonksiyonunu incelemede etkili olmuştur. Örneğin, MS hastalarından izole edilen MOG'a özgü antikorların EAE modellerinde klinik seyri ağırlaştırabileceği gösterilmiştir⁹. Özellikle, insan MOG'unda 42. pozisyondaki prolin kalıntısının, otoantikor patojenitesini¹⁰ belirlemek için kritik olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MOG'a özgü otoantikorların sadece miyelin kaybına aracılık ederek değil, aynı zamanda CNS¹¹ içindeki otoreaktif T hücrelerinin yeniden aktivasyonunu artırarak da hastalığı teşvik ettiği bulunmuştur.

CNS otoimmünitesinde antikor yanıtlarının önemi göz önüne alındığında, bu makale, MOG35-55 peptid ile aşılanmış C57BL / 6J farelerde otoreaktif antikorların serum seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için ELISA tabanlı bir protokol sunmaktadır. Protokolün ilk bölümünde, intrakardiyak ponksiyon yoluyla serum toplama yöntemi anlatılacaktır. Daha sonra, ELISA testini kurma ve verileri elde etme prosedürleri detaylandırılacaktır. Son olarak, veri analizi ve yorumlanması tartışılacaktır.

Protokol

Fareleri içeren tüm prosedürler, Doğu Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan deneysel kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8-10 haftalık yaşları arasında vahşi tip C57BL/6J dişi fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. EAE, daha önce yayınlanmış ^12,13,14 raporlarını takiben indüklenmiştir.

1. Serum toplama

1. Deney faresini, MOG35-55 bağışıklaması yoluyla EAE'yi indükledikten sonra gerekli zaman noktasında (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) CO₂ boğulması veya izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın.
   NOT: Toplam fare sayısı ve serum toplanması için zaman noktaları, spesifik deneye göre değişebilir.
2. Hayati belirtilerin yokluğu ayak parmağı veya kuyruk tutamağı ile onaylandıktan sonra, fareyi bir diseksiyon tepsisine dorsal yaslanma pozisyonuna getirin ve uzuvları pim veya bantla yerine sabitleyin. Hayvanın göğüs kafesini aydınlatmak için fare gövdesini LED ışık kaynağına yönlendirin ( Malzeme Tablosuna bakın).
3. Fare kürküne %70 etanol püskürtün ve herhangi bir organ ve ana damardan kaçınmaya dikkat ederek, disektör makasını kullanarak karın boyunca pelvisten ksifoide kadar 3-4 cm'lik bir orta hat kesisi yapın (Şekil 1A-C). Prosedürü kolaylaştırmak için, cildi ksifoid süreci boyunca tutmak için forseps kullanın.
4. Diyaframı yanlamasına kesin ve ardından yaylı makas kullanarak göğüs kafesini her iki yan kenardan önden kesin, orta hatta sternuma ulaşmadan önce durun (Şekil 1D). Kalbi ortaya çıkarmak için fare kafasının üzerinde oluşturulan kaburga kanadını katlayın (Şekil 1E).
   NOT: Sternumun kesilmesinden kaçınılmalıdır çünkü bu, kemiğe bitişik olarak yatan ana torasik arterlere zarar verecek ve toplanabilecek kan hacmini azaltacaktır.
5. 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi sol ventriküle sokun ve pistonu yavaşça geri çekerek kanı toplayın (Şekil 1F). İğne delinmesini kolaylaştırmak için, kalbi bir çift forseps'e karşı nazikçe destekleyin.
   NOT: Kan şırınganın içine hemen girmezse, iğne yavaşça döndürülmeli ve farklı bir açı test edilmelidir. Bununla birlikte, kalpte kanın dışarı sızabileceği gereksiz delikler oluşturmaktan kaçınmak için ilk denemede iğneyi düzgün bir şekilde yerleştirmek için çaba gösterilmelidir.
6. Kanı 1,5 mL'lik steril bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca pıhtılaşmasına izin verin. Pıhtıyı 2000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyerek çıkarın. Serum fraksiyonunu temsil eden süpernatanı toplayın ve gelecekteki testler için tek kullanımlık alikotları -80 ° C'de kriyojenik tüplerde saklayın.

2. ELISA testi

1. 10 mg / mL'lik bir stok elde etmek için liyofilize MOG35-55 peptidini (Malzeme Tablosuna bakınız) suda yeniden süspanse edin. Deneye başlamadan önce, stoğu kaplama tamponunda 10 μg/mL'ye seyreltin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve nihai çözeltinin 100 μL/oyusunu 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı yapışkan bir filmle kapatın ve plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Her numune için en az 2 kuyu hesaplanmalı ve boş bir kontrol için 2 ek kuyu da dahil edilmelidir.
2. Paralel olarak, aynı sayıda oyuğu 10 μg / mL konsantrasyonda kaplama tamponunda çözülmüş 100 μL / kuyu sığır serum albümini (BSA) ile kaplayın. Bu ek kuyular arka plan kontrolleri olarak hizmet edecektir.
   NOT: Kaplama ve engelleme tamponları farklı bileşimlere sahip olduğundan, kontrol kuyularının BSA ile kaplanması tavsiye edilir. Diğer ensefalitojenik peptitlerin (PLP139-151 veya MBP84-104 gibi) BSA'ya alternatif olarak ilgisiz antijenler olarak kullanılabileceğini lütfen unutmayın.
3. Ertesi gün, plakayı 3 kez% 0.05 Tween 20 (PBS-T) ile desteklenmiş 200 μL / kuyu fosfat tampon salin ile yıkayın. Daha sonra, PBS'de (Tween 20 olmadan) %3 BSA'dan yapılmış bir blokaj çözeltisinden 100 μL/kuyu ekleyin ve kapalı plakayı bir hibridizasyon fırınında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
4. Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. Her serum örneğini 1:100 oranında bloke edici solüsyon içinde seyreltin ve hem MOG35-55 hem de BSA kaplı kuyucuklara 100 μL / kuyu ekleyin. Boşluklar olarak belirlenen kuyucuklara aynı hacimde engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı kapalı olarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca sürekli çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.
5. Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. HRP ile konjuge ikincil antikoru (1:2000, Malzeme Tablosuna bakınız) PBS-T'de% 0.2 BSA'dan yapılmış bir çözelti içinde seyreltin ve tüm kuyucuklara 100 μL / kuyu ekleyin. Plakayı kapalı olarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca sürekli çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.
6. Plakayı 200 μL/kuyu PBS-T ile 3 kez yıkayın. Tüm kuyucuklara 100 μL/kuyu 3,3',5,5' tetrametilbenzidin (TMB) substratı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karanlıkta 1-5 dakika inkübe ederek mavi bir rengin gelişimini izleyin.
   1. 100 μL/kuyu durdurma çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 450 nm dalga boyuna ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak her kuyucuktaki optik yoğunluğu (OD) ölçün.
      NOT: TMB substratı, kuyucuklara eklenmeden önce 30-60 dakika oda sıcaklığında dengelenmelidir.

3. Veri analizi

1. Bir Excel elektronik tablosunu plakadan okunan OD değerleriyle doldurun. Her numune için çift kuyulardan (hem MOG35-55 hem de BSA kaplı) elde edilen OD değerlerinin ortalamasını alın.
2. Her numune için, BSA kaplı kuyucukların ortalama değerini MOG35-55 kaplı kuyucukların değerinden çıkarın. Elde edilen arka plan düzeltilmiş değerler, farklı serum örneklerinde anti-MOG35-55 antikorlarının konsantrasyonu ile orantılı olacaktır.
   NOT: Boş kuyular, 0 civarında düzeltilmiş değerlerle sonuçlanmalıdır.
3. İki deneysel koşul arasındaki ortalama OD değerlerini karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi gibi parametrik olmayan bir istatistiksel test uygulayın. Her koşul için en az 3 bağımsız örnek ekleyin.

Sonuçlar

Mevcut ELISA testinin sağlamlığını göstermek için, yöntem, tam Freund adjuvanında (CFA) 100 μg MOG35-55 peptid ile bağışıklamadan 20 gün sonra (dpi) bir C57BL / 6J dişi fare kohortundan izole edilen serum numuneleri üzerinde test edildi (CFA) doğrulanmış bir EAE indüksiyon protokolünü takiben ^12,13,14. Hayvanlar ayrıca 0. ve 2. günlerde 400 ng boğmaca toksini aldı. Sahte aşılanmış hayvanlardan alı...

Tartışmalar

Burada, MS patolojisinin ilgili bir hayvan modelinde humoral yanıtı doğru bir şekilde ölçmek için basit ve etkili bir ELISA tabanlı protokol bildirilmiştir. Bu yöntem, MOG35-55 / C57BL6J EAE paradigma^12'deki otoantikorların serum seviyelerini kontrol etmede ataksin-1 proteininin yeni rolünü tanımlamak için yakın zamanda kullanılmıştır. Bu bağlamda, bu yöntemle tutarlı ve biyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için bir dizi faktör göz önünde bulundurulmalıdır.<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531