JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это животная модель рассеянного склероза (РС), которая разделяет с болезнью человека устойчивый гуморальный аутоиммунный ответ. Здесь мы сообщаем о простом и гибком протоколе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке мышей, иммунизированных EAE.

Аннотация

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это модель заболевания, которая повторяет аутоиммунное заболевание рассеянный склероз (РС) на гистопатологическом и молекулярном уровнях. ЭАЭ индуцируется иммунизацией экспериментальных животных путем подкожной инъекции коротких пептидов миелина вместе со специфическими адъювантами для усиления иммунного ответа. Как и у человека, у мышей EAE развиваются демиелинизирующие поражения, инфильтрация иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), активация глии и повреждение нейронов. Последовательная совокупность доказательств также поддерживает механистическую роль дисфункции В-клеток в этиологии как РС, так и ЭАЭ. В-клетки могут служить антигенпрезентирующими клетками, а также основным источником провоспалительных цитокинов и аутоантител. При EAE вырабатываются антитела против пептидов миелина, которые были использованы для индуцирования заболевания. Было показано, что такие аутоантитела опосредуют либо потерю миелина, либо реактивацию патогенных Т-клеток в ЦНС. В данной статье описан эффективный протокол на основе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке крови мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом миелина олигодендроцитарного гликопротеина 35-55 (MOG35-55). Предложенный метод служит мощным инструментом для исследования специфичности и величины аберрантного гуморального ответа в контексте аутоиммунной демиелинизации.

Введение

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся очаговой инфильтрацией иммунных клеток в паренхиму головного мозга, разрушением миелиновых оболочек, обволакивающих аксоны, активацией глии и потерей нейронов1. В дополнение к хорошо установленной роли патогенных Т-клеток, многочисленные линии доказательств подчеркнули участие В-клеток в опосредовании аутоиммунного ответа против ЦНС. В-клетки подвергаются клональной экспансии в мозге РС, и антитела против компонентов миелина были обнаружены в демиелинизированных поражениях 2,3. Недавно была задокументирована селективная активация периферических В-клеток в начале заболевания, что предполагает предполагаемую роль этого компартмента иммунных клеток в инициации заболевания4. Успех терапии, истощающей В-клетки, такой как моноклональные антитела против CD20, еще больше подтверждает механистическую связь между аберрантным функционированием В-клеток и аутоиммунной демиелинизацией 5,6. С молекулярной точки зрения, В-клетки могут способствовать заболеванию через презентацию аутоантигена, секрецию провоспалительных цитокинов и выработку аутореактивных антител.

Было разработано несколько животных моделей, чтобы обобщить специфические особенности сложного фенотипа рассеянного склероза. Среди них экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является наиболее широко используемой парадигмой in vivo и опирается на иммунизацию экспериментальных животных короткими пептидами, полученными из белков миелина, таких как гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG) и основной белок миелина (MBP)7. У животных, иммунизированных EAE, развивается демиелинизирующая патология, которая во многих аспектах напоминает рассеянный склероз, включая устойчивый гуморальный ответ против энцефалитогенного пептида8. По этой причине исследования ЭАЭ сыграли важную роль в анализе функции В-клеток и аутоантител в контексте заболевания. Например, было показано, что MOG-специфические антитела, выделенные у пациентов с РС, могут усугубить клиническое течение в модели ЭАЭ9. Примечательно, что остаток пролина в положении 42 в MOG человека имеет решающее значение для определения патогенности аутоантител10. Совсем недавно было обнаружено, что MOG-специфические аутоантитела способствуют заболеванию не только за счет опосредования потери миелина, но и за счет повышения реактивации аутореактивных Т-клеток в ЦНС11.

Учитывая важность ответов антител при аутоиммунных заболеваниях ЦНС, в данной статье представлен протокол на основе ИФА для эффективного измерения сывороточных уровней аутореактивных антител у мышей ЭАЭ C57BL/6J, иммунизированных пептидом MOG35-55. В первой части протокола будет описан метод сбора сыворотки с помощью внутрисердечной пункции. Затем будут подробно описаны процедуры настройки ИФА-анализа и получения данных. Наконец, будет обсуждаться анализ и интерпретация данных.

протокол

Все процедуры с участием мышей были выполнены в соответствии с экспериментальными рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Восточной Каролины. В этом исследовании использовались самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). ЭАЭ была индуцирована после ранее опубликованных отчетов 12,13,14.

1. Сбор сыворотки

  1. Усыпить подопытную мышь путем удушьяСО2 или передозировки изофлурана в требуемый момент времени (в соответствии с институционально утвержденными протоколами) после индукции ЭАЭ с помощью иммунизации MOG35-55.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество мышей и временные моменты сбора сыворотки могут варьироваться в зависимости от конкретного эксперимента.
  2. После того, как отсутствие жизненно важных признаков будет подтверждено защемлением пальца ноги или хвоста, поместите мышь в положение лежачего на спине на подносе для вскрытия и закрепите конечности булавками или лентой. Сориентируйте корпус мыши на светодиодный источник света (см. Таблицу материалов), чтобы осветить грудную клетку животного.
  3. Сбрызните шерсть мыши 70% этанолом и сделайте разрез по средней линии 3-4 см вдоль живота от таза до мечевидной кости с помощью диссекторных ножниц, стараясь избегать каких-либо органов и крупных сосудов (рис. 1A-C). Чтобы облегчить процедуру, используйте щипцы, чтобы захватить кожу над мечевидным отростком.
  4. Разрежьте диафрагму сбоку, а затем разрежьте грудную клетку спереди по обоим боковым краям с помощью пружинных ножниц, останавливаясь, не доходя до грудины по средней линии (рисунок 1D). Сложите ребристый клапан, который был создан над головой мыши, чтобы обнажить сердце (рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать разреза грудины, так как это повредит основные грудные артерии, прилегающие к кости, и уменьшит объем крови, которую можно собрать.
  5. Введите иглу 25 G, соединенную со шприцем объемом 1 мл, в левый желудочек и соберите кровь, осторожно потянув поршень назад (рисунок 1F). Чтобы облегчить прокол иглой, аккуратно прижмите сердце к щипцам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь не сразу попадает в шприц, иглу следует медленно вращать и проверить другой угол. Тем не менее, следует приложить усилия, чтобы правильно разместить иглу с первой попытки, чтобы избежать создания ненужных отверстий в сердце, из которых может вытекать кровь.
  6. Переложите кровь в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и дайте ей свертываться в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить сгусток центрифугированием при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, которая представляет собой сывороточную фракцию, и храните одноразовые аликвоты в криогенных пробирках при температуре -80 °C для будущих испытаний.

2. ИФА-анализ

  1. Ресуспендируйте лиофилизированный пептид MOG35-55 (см. Таблицу материалов) в воде с получением запаса 10 мг/мл. Перед началом эксперимента разбавьте массу до 10 мкг/мл в буфере для покрытия (см. Таблицу материалов) и пипетируйте 100 мкл/лунку конечного раствора в 96-луночный планшет. Запечатайте планшет клейкой пленкой, чтобы избежать испарения, и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пробы следует рассчитать не менее 2 лунок, а также включить 2 дополнительные скважины для контроля холостого колодца.
  2. Параллельно покрыть то же количество лунок 100 μл/лунку бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенным в буфере покрытия в концентрации 10 мкг/мл. Эти дополнительные скважины будут служить фоновым контролем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные лунки рекомендуется покрыть БСА, так как покрытие и блокирующие буферы имеют разный состав. Обратите внимание, что другие энцефалитогенные пептиды (такие как PLP139-151 или MBP84-104) могут быть использованы в качестве нерелевантных антигенов в качестве альтернативы BSA.
  3. На следующий день промойте планшет 3 раза 200 μл фосфатного буферного раствора с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T). Затем добавляют 100 л/лунку блокирующего раствора, изготовленного из 3% БСА, в PBS (без Tween 20) и инкубируют планшет в герметичном виде в течение 1 ч при 37 °C в гибридизационной печи.
  4. Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Разбавьте каждый образец сыворотки 1:100 в блокирующем растворе и добавьте 100 мкл/лунку в лунки с покрытием MOG35-55 и BSA. Добавьте такой же объем запорного раствора в лунки, обозначенные как заготовки. Инкубировать укупоренную пластину в течение 2 ч при комнатной температуре, при постоянном встряхивании (250 об/мин).
  5. Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Разбавить HRP-конъюгированное вторичное антитело (1:2000, см. таблицу материалов) в растворе, изготовленном из 0,2% BSA в PBS-T и добавить 100 мкл/лунку во все лунки. Инкубировать планшет в закрытом виде в течение 1 ч при комнатной температуре, при постоянном встряхивании (250 об/мин).
  6. Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Добавьте во все лунки 100 мкл/лунку субстрата 3,3',5,5' тетраметилбензидина (ТМБ) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в темноте в течение 1-5 мин, наблюдая за развитием синего цвета.
    1. Остановите реакцию, добавив 100 μл/лунку стоп-раствора (см. Таблицу материалов) и измерьте оптическую плотность (OD) в каждой лунке с помощью планшетного ридера, установленного на длине волны 450 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субстрат TMB следует уравновесить при комнатной температуре в течение 30-60 минут, прежде чем добавлять его в лунки.

3. Анализ данных

  1. Заполните электронную таблицу Excel значениями наружного диаметра, считанными с таблички. Усреднить значения наружного диаметра, полученные из дублирующих скважин (как с покрытием MOG35-55, так и с покрытием BSA) для каждой пробы.
  2. Для каждого образца вычтите среднее значение лунок с покрытием BSA из значения лунок с покрытием MOG35-55. Полученные фоновые скорректированные значения будут пропорциональны концентрации антител против MOG35-55 в различных образцах сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые колодцы должны приводить к скорректированным значениям около 0.
  3. Примените непараметрический статистический критерий, такой как U-критерий Манна-Уитни, чтобы сравнить средние значения наружного диаметра в двух экспериментальных условиях. Включите не менее 3 независимых образцов для каждого состояния.

Результаты

Чтобы продемонстрировать надежность настоящего ИФА-анализа, метод был протестирован на образцах сыворотки, выделенных из когорты самок мышей C57BL/6J через 20 дней после иммунизации (dpi) со 100 мкг пептида MOG35-55 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в соответствии с валидированным протоколом индукци...

Обсуждение

Здесь сообщалось о простом и эффективном протоколе на основе ИФА для точной количественной оценки гуморального ответа в соответствующей животной модели патологии рассеянного склероза. Этот метод недавно был использован для описания новой роли белка атаксина-1 в контроле сывороточны?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (R03NS131908) и Министерством обороны в рамках Программы исследований рассеянного склероза в рамках награды No W81XWH-22-1-0517. Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобрены Министерством обороны. Это исследование также было поддержано стартап-фондами Университета Восточной Каролины.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringesBD Biosciences309628
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher05-408-129
25 G needlesBD Biosciences305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrateThermo FisherN301Store at 4 °C
Adhesive sealsThermo FisherAB0558
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906Store at 4 °C
C57BL/6J female miceThe Jackson Laboratory000664Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubesFisher10-500-25
Dissection trayFisherS111022
Dissector scissorsFine Science Tools14082-09
ELISA coating bufferBioLegend421701Store at 4°C
Excel softwareMicrosoftAnalysis spreadsheet
ForcepsFine Science Tools11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRPSouthernBiotech1030-05Store at 4 °C
LED light sourceFisherAMPSILED21
Microplate readerFisher14-377-575 
Molecular biology grade waterCorning46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptideEZBiolabcp7203Store at -80 °C
Multichannel pipetteAxygenAP-12-200-P
Noyes spring scissorsFine Science Tools15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well platesBioLegend423501
Orbital shakerFisher88-861-023
OvenVWR445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)Thermo Fisher14190144
Refrigerated tabletop centrifugeThermo Fisher75002441
Stop solutionThermo FisherN600
Tween 20Bio-Rad1706531

Ссылки

  1. Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
  2. Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
  3. Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
  4. Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
  5. Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
  6. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
  7. Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
  8. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  9. Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
  10. Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
  11. Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
  12. Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
  13. Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
  14. Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
  15. Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены