Количественная оценка аутореактивных антител у мышей при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

Резюме

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это животная модель рассеянного склероза (РС), которая разделяет с болезнью человека устойчивый гуморальный аутоиммунный ответ. Здесь мы сообщаем о простом и гибком протоколе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке мышей, иммунизированных EAE.

Аннотация

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это модель заболевания, которая повторяет аутоиммунное заболевание рассеянный склероз (РС) на гистопатологическом и молекулярном уровнях. ЭАЭ индуцируется иммунизацией экспериментальных животных путем подкожной инъекции коротких пептидов миелина вместе со специфическими адъювантами для усиления иммунного ответа. Как и у человека, у мышей EAE развиваются демиелинизирующие поражения, инфильтрация иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), активация глии и повреждение нейронов. Последовательная совокупность доказательств также поддерживает механистическую роль дисфункции В-клеток в этиологии как РС, так и ЭАЭ. В-клетки могут служить антигенпрезентирующими клетками, а также основным источником провоспалительных цитокинов и аутоантител. При EAE вырабатываются антитела против пептидов миелина, которые были использованы для индуцирования заболевания. Было показано, что такие аутоантитела опосредуют либо потерю миелина, либо реактивацию патогенных Т-клеток в ЦНС. В данной статье описан эффективный протокол на основе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке крови мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом миелина олигодендроцитарного гликопротеина 35-55 (MOG35-55). Предложенный метод служит мощным инструментом для исследования специфичности и величины аберрантного гуморального ответа в контексте аутоиммунной демиелинизации.

Введение

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся очаговой инфильтрацией иммунных клеток в паренхиму головного мозга, разрушением миелиновых оболочек, обволакивающих аксоны, активацией глии и потерей нейронов¹. В дополнение к хорошо установленной роли патогенных Т-клеток, многочисленные линии доказательств подчеркнули участие В-клеток в опосредовании аутоиммунного ответа против ЦНС. В-клетки подвергаются клональной экспансии в мозге РС, и антитела против компонентов миелина были обнаружены в демиелинизированных поражениях ^2,3

протокол

Все процедуры с участием мышей были выполнены в соответствии с экспериментальными рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Восточной Каролины. В этом исследовании использовались самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). ЭАЭ была индуцирована после ранее опубликованных отчетов 12,13,14.

1. Сбор сыворотки

1. Усыпить подопытную мышь путем....

Результаты

Чтобы продемонстрировать надежность настоящего ИФА-анализа, метод был протестирован на образцах сыворотки, выделенных из когорты самок мышей C57BL/6J через 20 дней после иммунизации (dpi) со 100 мкг пептида MOG35-55 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в соответствии с валидированным протоколом индукци.......

Обсуждение

Здесь сообщалось о простом и эффективном протоколе на основе ИФА для точной количественной оценки гуморального ответа в соответствующей животной модели патологии рассеянного склероза. Этот метод недавно был использован для описания новой роли белка атаксина-1 в контроле сывороточны?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531