Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

Riepilogo

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Abstract

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello di malattia che ricapitola la malattia autoimmune della sclerosi multipla (SM) a livello istopatologico e molecolare. L'EAE è indotto dall'immunizzazione di animali da esperimento tramite iniezione sottocutanea di peptidi di mielina corta insieme a coadiuvanti specifici per aumentare la risposta immunitaria. Come la controparte umana, i topi EAE sviluppano lesioni demielinizzanti, infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC), attivazione della glia e danno neuronale. Un corpo coerente di prove supporta anche un ruolo meccanicistico per la disfunzione delle cellule B nell'eziologia sia della SM che dell'EAE. Le cellule B possono fungere da cellule presentanti l'antigene e da fonte primaria di citochine pro-infiammatorie e autoanticorpi. Nell'EAE, vengono generati anticorpi contro i peptidi mielinici che sono stati impiegati per indurre la malattia. È stato dimostrato che tali autoanticorpi mediano la perdita di mielina o la riattivazione delle cellule T patogene nel SNC. Questo articolo descrive un efficiente protocollo basato su ELISA per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi C57BL/6J immunizzati con il peptide della glicoproteina 35-55 degli oligodendrociti mielinici (MOG35-55). Il metodo proposto funge da potente strumento per studiare la specificità e l'entità della risposta umorale aberrante nel contesto della demielinizzazione autoimmune.

Introduzione

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione focale di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale, rottura delle guaine mieliniche che avvolgono gli assoni, attivazione della glia e perdita neuronale¹. Oltre al ruolo ben consolidato delle cellule T patogene, molteplici linee di evidenza hanno evidenziato il coinvolgimento delle cellule B nella mediazione della risposta autoimmune contro il SNC. Le cellule B subiscono un'espansione clonale nel cervello della SM e sono stati rilevati anticorpi contro i componenti della mielina all'interno delle lesioni demielinich....

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità con le linee guida sperimentali approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Carolina orientale. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina Wildtype C57BL / 6J di età compresa tra 8 e 10 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'EAE è stato indotto a seguito di rapporti precedentemente pubblicati 12,13,14.

1. Raccolta del siero

Discussione

Qui, è stato riportato un protocollo basato su ELISA semplice ed efficiente per quantificare accuratamente la risposta umorale in un modello animale rilevante di patologia della SM. Questo metodo è stato recentemente impiegato per descrivere il nuovo ruolo della proteina atassina-1 nel controllo dei livelli sierici di autoanticorpi nel paradigma EAE MOG35-55/C57BL6J¹². A questo proposito, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori, al fine di ottenere risultati coerenti e biol.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531