Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.

Résumé

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle de maladie qui récapitule la maladie auto-immune de la sclérose en plaques (SEP) aux niveaux histopathologique et moléculaire. L’EAE est induite par l’immunisation d’animaux de laboratoire par injection sous-cutanée de peptides de myéline courts associés à des adjuvants spécifiques pour stimuler la réponse immunitaire. Comme leurs homologues humains, les souris EAE développent des lésions démyélinisantes, une infiltration de cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC), une activation gliale et des lésions neuronales. De nombreuses données probantes confirment également l’existence d’un rôle mécaniste du dysfonctionnement des lymphocytes B dans l’étiologie de la SP et de l’EAE. Les lymphocytes B peuvent servir de cellules présentatrices d’antigènes ainsi que de source primaire de cytokines pro-inflammatoires et d’auto-anticorps. Dans l’EAE, des anticorps sont générés contre les peptides de myéline qui ont été utilisés pour induire la maladie. Il a été démontré que ces auto-anticorps médient soit la perte de myéline, soit la réactivation des lymphocytes T pathogènes dans le SNC. Cet article décrit un protocole efficace basé sur l’ELISA pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris C57BL/6J immunisées avec le peptide de la glycoprotéine 35-55 de la myéline oligodendrocyte (MOG35-55). La méthode proposée constitue un outil puissant pour étudier la spécificité et l’ampleur de la réponse humorale aberrante dans le contexte de la démyélinisation auto-immune.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration focale de cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral, une dégradation des gaines de myéline enveloppant les axones, une activation de la glie et une perte neuronale¹. En plus du rôle bien établi des lymphocytes T pathogènes, de multiples éléments de preuve ont mis en évidence l’implication des lymphocytes B dans la médiation de la réponse auto-immune contre le SNC. Les lymphocytes B subissent une expansion clonale dans le cerveau de la SP et des anticorps dirigés contre les composants de la myéline ont été détectés dans les lésions démyélinisées ^2,3. L’activation sélective des lymphocytes B périphériques au début de la maladie a été récemment documentée, suggérant un rôle présumé de ce compartiment cellulaire immunitaire dans l’initiation de la maladie⁴. Le succès des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B, telles que les anticorps monoclonaux anti-CD20, corrobore davantage le lien mécaniste entre le fonctionnement aberrant des lymphocytes B et la démyélinisation auto-immune ^5,6. D’un point de vue moléculaire, les lymphocytes B peuvent contribuer à la maladie via la présentation d’auto-antigènes, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et la production d’anticorps autoréactifs.

De multiples modèles animaux ont été mis au point pour récapituler les caractéristiques spécifiques du phénotype complexe de la SP. Parmi eux, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le paradigme in vivo le plus largement utilisé et repose sur l’immunisation d’animaux de laboratoire avec des peptides courts dérivés de protéines de myéline telles que la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) et la protéine basique de la myéline (MBP)⁷. Les animaux immunisés contre l’EAE développent une pathologie démyélinisante qui ressemble à la SEP à bien des égards, y compris une réponse humorale robuste contre le peptide encéphalitogène8. Pour cette raison, les études EAE ont joué un rôle déterminant dans la dissection de la fonction des lymphocytes B et des auto-anticorps dans le contexte de la maladie. Par exemple, il a été démontré que les anticorps spécifiques de MOG isolés chez des patients atteints de SEP peuvent aggraver l’évolution clinique dans les modèles EAE⁹. Notamment, le résidu de proline à la position 42 dans le MOG humain s’est avéré essentiel pour déterminer la pathogénicité des auto-anticorps¹⁰. Plus récemment, il a été constaté que les auto-anticorps spécifiques de MOG favorisent la maladie non seulement en médiant la perte de myéline, mais aussi en stimulant la réactivation des lymphocytes T autoréactifs dans le SNC¹¹.

Compte tenu de l’importance des réponses anticorps dans l’auto-immunité du SNC, cet article présente un protocole basé sur ELISA pour mesurer efficacement les taux sériques d’anticorps autoréactifs chez les souris C57BL/6J EAE immunisées avec le peptide MOG35-55. Dans la première partie du protocole, la méthode de prélèvement du sérum par ponction intracardiaque sera décrite. Par la suite, les procédures de mise en place du test ELISA et d’acquisition des données seront détaillées. Enfin, l’analyse et l’interprétation des données seront abordées.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris ont été effectuées conformément aux directives expérimentales approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline de l’Est (IACUC). Des souris femelles Wildtype C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux proviennent d’une source commerciale (voir la Table des matières). L’EAE a été induite à la suite de rapports précédemment publiés 12,13,14.

1. Collection de sérum

1. Euthanasier la souris expérimentale par asphyxie au CO₂ ou surdose d’isoflurane au moment requis (selon les protocoles approuvés par l’établissement) après avoir induit l’EAE par l’immunisation MOG35-55.
   REMARQUE : Le nombre total de souris et les points temporels pour la collecte du sérum peuvent varier en fonction de l’expérience spécifique.
2. Une fois que l’absence de signes vitaux est confirmée par un pincement des orteils ou de la queue, placez la souris en position de décubitus dorsal sur un plateau de dissection et fixez les membres en position avec des épingles ou du ruban adhésif. Orientez le corps de la souris sur la source lumineuse LED (voir tableau des matériaux) pour éclairer le thorax de l’animal.
3. Vaporisez la fourrure de souris avec de l’éthanol à 70 % et faites une incision médiane de 3 à 4 cm le long de l’abdomen, du bassin au xiphoïde, à l’aide des ciseaux de dissecteur, en prenant soin d’éviter les organes et les principaux vaisseaux (Figure 1A-C). Pour faciliter la procédure, utilisez la pince pour saisir la peau au-dessus du processus xiphoïde.
4. Coupez le diaphragme latéralement, puis coupez la cage thoracique vers l’avant sur les deux bords latéraux à l’aide des ciseaux à ressort, en vous arrêtant avant d’atteindre le sternum sur la ligne médiane (Figure 1D). Repliez le rabat de nervure créé sur la tête de la souris pour exposer le cœur (Figure 1E).
   REMARQUE : Il est à éviter de couper le sternum car cela endommagerait les principales artères thoraciques adjacentes à l’os et réduirait le volume de sang pouvant être collecté.
5. Insérez une aiguille de 25 g reliée à une seringue de 1 mL dans le ventricule gauche et prélevez le sang en tirant doucement le piston vers l’arrière (figure 1F). Pour faciliter la ponction de l’aiguille, calez doucement le cœur contre une paire de pinces.
   REMARQUE : Si le sang n’apparaît pas immédiatement dans la seringue, l’aiguille doit être tournée lentement et un angle différent doit être testé. Cependant, des efforts doivent être faits pour placer correctement l’aiguille dès la première tentative afin d’éviter de créer des trous inutiles dans le cœur où le sang peut s’échapper.
6. Transférez le sang dans un tube stérile de 1,5 ml et laissez-le coaguler pendant 30 minutes à température ambiante. Retirer le caillot par centrifugation à 2000 × g pendant 20 min à 4 °C. Prélever le surnageant, qui représente la fraction sérique, et stocker les aliquotes à usage unique dans des tubes cryogéniques à -80 °C pour des tests futurs.

2. Dosage ELISA

1. Remettre en suspension le peptide MOG35-55 lyophilisé (voir tableau des matières) dans l’eau pour obtenir un stock de 10 mg/mL. Avant de commencer l’expérience, diluer la substance à 10 μg/mL dans un tampon de revêtement (voir le tableau des matériaux) et pipeter 100 μL/puits de la solution finale dans une plaque à 96 puits. Scellez la plaque avec un film adhésif pour éviter l’évaporation et incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Au moins 2 puits doivent être calculés pour chaque échantillon et 2 puits supplémentaires doivent également être inclus pour un contrôle à blanc.
2. En parallèle, enduire le même nombre de puits avec 100 μL/puits d’albumine sérique bovine (BSA) dissoute dans un tampon d’enrobage à une concentration de 10 μg/mL. Ces puits supplémentaires serviront de contrôles en arrière-plan.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enduire avec BSA les puits de contrôle car les tampons de revêtement et de blocage ont des compositions différentes. Veuillez noter que d’autres peptides encéphalitogènes (tels que PLP139-151 ou MBP84-104) pourraient être utilisés comme antigènes non pertinents en alternative à la BSA.
3. Le lendemain, laver la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de solution saline tampon phosphatée complétée par 0,05 % de Tween 20 (PBS-T). Par la suite, ajouter 100 μL/puits d’une solution bloquante composée de 3 % de BSA dans du PBS (sans Tween 20) et incuber la plaque scellée pendant 1 h à 37 °C dans un four d’hybridation.
4. Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer chaque échantillon de sérum à 1:100 dans une solution bloquante et ajouter 100 μL/puits dans les puits revêtus de MOG35-55 et de BSA. Ajouter le même volume de solution de blocage dans les puits désignés comme blancs. Incuber la plaque scellée pendant 2 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).
5. Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à la HRP (1:2000, voir le tableau des matériaux) dans une solution composée de 0,2 % de BSA dans du PBS-T et ajouter 100 μL/puits à tous les puits. Incuber la plaque scellée pendant 1 h à température ambiante, en agitant constamment (250 tr/min).
6. Lavez la plaque 3 fois avec 200 μL/puits de PBS-T. Ajouter 100 μL/puits de substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) 3,3',5,5' (voir le tableau des matériaux) à tous les puits et incuber dans l’obscurité pendant 1 à 5 min, en surveillant le développement d’une couleur bleue.
   1. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μL/puits de solution d’arrêt (voir le tableau des matériaux) et mesurez la densité optique (DO) dans chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques réglé à une longueur d’onde de 450 nm.
      REMARQUE : Le substrat TMB doit être équilibré à température ambiante pendant 30 à 60 minutes avant de l’ajouter dans les puits.

3. Analyse des données

1. Remplissez une feuille de calcul Excel avec les valeurs OD lues à partir de la plaque. Faites la moyenne des valeurs de DO obtenues à partir de puits dupliqués (MOG35-55 et revêtus de BSA) pour chaque échantillon.
2. Pour chaque échantillon, soustraire la valeur moyenne des puits revêtus de BSA de celle des puits revêtus de MOG35-55. Les valeurs corrigées du bruit de fond qui en résultent seront proportionnelles à la concentration d’anticorps anti-MOG35-55 dans les différents échantillons de sérum.
   REMARQUE : Les puits vides doivent donner des valeurs corrigées autour de 0.
3. Appliquez un test statistique non paramétrique tel que le test U de Mann-Whitney pour comparer les valeurs moyennes de DO entre deux conditions expérimentales. Incluez au moins 3 échantillons indépendants pour chaque condition.

Résultats

Pour démontrer la robustesse du test ELISA actuel, la méthode a été testée sur des échantillons de sérum isolés d’une cohorte de souris femelles C57BL/6J à 20 jours après l’immunisation (dpi) avec 100 μg de peptide MOG35-55 dans l’adjuvant de Freund complet (CFA) selon un protocole d’induction EAE validé 12,13,14. Les animaux ont également reçu 400 ng de toxine coqueluche les jours 0 et 2. Des échantillons...

Discussion

Ici, un protocole simple et efficace basé sur l’ELISA a été rapporté pour quantifier avec précision la réponse humorale dans un modèle animal pertinent de la pathologie de la SEP. Cette méthode a récemment été utilisée pour décrire le nouveau rôle de la protéine ataxine-1 dans le contrôle des taux sériques d’auto-anticorps dans le paradigme MOG35-55/C57BL6J EAE¹². À cet égard, un certain nombre de facteurs doivent être pris en considération afin d’obtenir des résultats ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Biosciences	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
25 G needles	BD Biosciences	305122
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate	Thermo Fisher	N301	Store at 4 °C
Adhesive seals	Thermo Fisher	AB0558
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906	Store at 4 °C
C57BL/6J female mice	The Jackson Laboratory	000664	Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments
Cryogenic tubes	Fisher	10-500-25
Dissection tray	Fisher	S111022
Dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
ELISA coating buffer	BioLegend	421701	Store at 4°C
Excel software	Microsoft		Analysis spreadsheet
Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP	SouthernBiotech	1030-05	Store at 4 °C
LED light source	Fisher	AMPSILED21
Microplate reader	Fisher	14-377-575
Molecular biology grade water	Corning	46-000-Cl
Mouse MOG35-55 peptide	EZBiolab	cp7203	Store at -80 °C
Multichannel pipette	Axygen	AP-12-200-P
Noyes spring scissors	Fine Science Tools	15011-12
Nunc MaxiSorp 96-well plates	BioLegend	423501
Orbital shaker	Fisher	88-861-023
Oven	VWR	445-0024
Phosphate buffer saline (PBS)	Thermo Fisher	14190144
Refrigerated tabletop centrifuge	Thermo Fisher	75002441
Stop solution	Thermo Fisher	N600
Tween 20	Bio-Rad	1706531